李 軍，趙榮榮，喬媛媛，王 偉，文 鋒，劉軍強(qiáng)，范博士

食管癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其中鱗狀細(xì)胞癌占90%以上，盡管診療的手段不斷進(jìn)步，但食管癌的5年生存率仍低于20%[1-3]，初診分期較晚、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是其主要原因。隨著對(duì)食管鱗癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)研究的深入，提示其對(duì)監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有重要意義，可以指導(dǎo)治療，改善預(yù)后[4]。近年來，CTCs的檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)，但各有利弊，尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究旨在利用密度梯度離心法聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)食管鱗癌和健康人外周血CTCs，嘗試建立一種高效簡(jiǎn)單易行的食管鱗癌CTCs富集和分離方法。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年10月—2018年5月中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心胸外科收治的食管鱗癌患者的外周血，共20例。納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前經(jīng)病理學(xué)診斷為食管鱗癌；患者及家屬充分知情，簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理為非鱗癌；食管穿孔；感染；惡病質(zhì)。同時(shí)收集我院5例健康志愿者血樣作為對(duì)照。

1.2 抗體、主要試劑及設(shè)備 Anti-EpCAM-APC、anti-Cytokeratin (CK)-FITC及anti-CD45-PerCP抗體均購(gòu)自德國(guó)美天旎公司；流式固定液和破膜液購(gòu)自美國(guó)BD公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)由我院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 食管鱗癌細(xì)胞系的培養(yǎng)及流式檢測(cè) 選用3個(gè)食管鱗癌細(xì)胞系EC9706、EC9706P(由EC9706細(xì)胞系經(jīng)過Transwell篩選出的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系)[5]及Kyse-170，將其從液氮中取出，迅速放入37 ℃溫水中，加入10% FBS的DMEM高糖及RPMI 1640培養(yǎng)基中混勻。然后以1 000 r/min離心5 min，棄上清。EC9706及EC9706P細(xì)胞系加入含有10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，Kyse-170加入含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，反復(fù)吹吸細(xì)胞，移至培養(yǎng)瓶，各自補(bǔ)加10%FBS的兩種培養(yǎng)基至5 mL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集3種細(xì)胞系，分別加入anti-EpCAM-APC(anti-CD326-APC)，anti-CD45-PerCP抗體，常溫下避光孵育15 min，經(jīng)固定透化后再加入anti-CK-FITC，常溫避光孵育30 min，加入1 mL PBS，洗滌，離心5 min，棄上清。用500 μL PBS重懸細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行CTCs檢測(cè)。

1.4 標(biāo)本采集及外周血單個(gè)核細(xì)胞的分選 從肘正中靜脈用含EDTA采血管采集清晨空腹外周血7.5 mL，為防止靜脈穿剌過程中上皮細(xì)胞的污染，前2 mL不收集到目的采血管中。采集后于室溫保存，并進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分選。步驟：將外周血用同樣體積的PBS稀釋至15 mL，緩慢加入Ficoll分離液面上(外周血稀釋液∶Ficoll分離液=1∶1)，放入水平離心機(jī)2 000 r/min離心20 min，吸去最上層血清，盡量吸取中間白膜層，即PBMC層，然后加入10 mL的PBS，1 500 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)1次。加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，靜置5 min，1 500 r/min離心10 min。分離后的細(xì)胞即為PBMC。

1.5 敏感性實(shí)驗(yàn) 將EC9706細(xì)胞加入到PBMC中，EC9706細(xì)胞與PBMC的比例分別為1∶106，5∶106，1∶105，5∶105，1∶104，用anti-EpCAM-APC，anti-CD45-PerCP進(jìn)行表面染色，染色完成后加固定破膜液處理，加入抗體anti-CK-FITC，常溫避光孵育30 min，加入1 mL PBS，洗滌，離心5 min，棄上清，用500 μL PBS重懸細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行CTCs檢測(cè)。結(jié)果以外周血每106PBMC中CK+、EpCAM+、CD45-細(xì)胞數(shù)來表示外周血中的腫瘤細(xì)胞含量，即CTCs單位為×10-6。參考既往研究結(jié)果，本研究以CTCs數(shù)量<3為檢出陰性，CTCs數(shù)量≥3為檢出陽(yáng)性[6]。

1.6 特異性實(shí)驗(yàn) 按照1.4描述的方法采集食管鱗癌患者及健康志愿者外周血7.5 mL并進(jìn)行PBMC的分離，分離后按照1.5描述的染色方法完成染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中CTCs。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果利用CellQuest軟件自動(dòng)生成各種散點(diǎn)圖及數(shù)據(jù)結(jié)果。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率表示，組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌細(xì)胞系中EpCAM和CK表達(dá) 3種細(xì)胞系在CD45-細(xì)胞群中EpCAM及CK的比例見圖1。

圖1 3種細(xì)胞系中EpCAM及CK在CD45-細(xì)胞群中的比例

2.2 CTCs的確定 ①以側(cè)向反散射(SS)對(duì)前向散射(FS)作二維散射點(diǎn)，設(shè)R1門(圖2)；②取R1門，以SS對(duì)CD45-PerCP作二維散射點(diǎn)，選擇CD45-細(xì)胞設(shè)R2門(圖3)；③取R2門，以CK-FITC對(duì)EpCAM-APC(CD326-APC)作二維散射點(diǎn)，選擇EpCAM+CK+細(xì)胞設(shè)定為CTCs(圖4)。

圖2 FSC、SSC二維散點(diǎn)圖

圖3 CD45 PerCP單染二維散點(diǎn)圖

圖4 CD326 APC/CK FITC雙染樣本分析圖

2.3 敏感性和特異性驗(yàn)證 將不同數(shù)量的食管鱗癌細(xì)胞摻入到健康志愿者2 mL抗凝血中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CTCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周血每106個(gè)細(xì)胞可檢出1個(gè)CTCs，證明該方法敏感度高。實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)了20例食管鱗癌及5名健康志愿者外周血樣(見表1)。其中5例健康志愿者外周血CTCs檢測(cè)為陰性，而20例食管鱗癌中有15例均檢測(cè)到CTCs，CTCs陽(yáng)性率達(dá)到75%，明顯高于健康志愿者，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.955，P=0.004 8)，表明密度梯度離心結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)可以更高效的檢測(cè)到食管鱗癌外周血中的CTCs，敏感性和特異性好。

表1 食管鱗癌患者和健康志愿者外周血CTCs陽(yáng)性率

3 討論

CTCs是指自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的一類腫瘤細(xì)胞[7]，在腫瘤的早期篩查、療效評(píng)估、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面具有重要意義，而且具有創(chuàng)傷小、可連續(xù)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，一直是腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[8]。近年來隨著液體活檢、二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)ctDNA的檢測(cè)有逐漸替代針對(duì)CTCs細(xì)胞檢測(cè)的趨勢(shì)，但尚無證據(jù)支持片段化的ctDNA提供的信息能夠提高疾病的治療效果，改善預(yù)后[9]，而完整CTCs細(xì)胞的檢測(cè)，不但可以判斷細(xì)胞數(shù)量，更能夠提供全面的細(xì)胞變化的信息和數(shù)據(jù)，但由于CTCs在外周血中含量極其稀少，對(duì)于CTCs的富集分離和鑒定一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[10-12]。

目前，CTCs的富集方法主要包括基于形態(tài)學(xué)的富集法、免疫磁性分離法和微芯片技術(shù)等，CTCs的鑒定技術(shù)包括核酸分析法、免疫細(xì)胞化學(xué)法、流式細(xì)胞分析法、功能分析法等，單一方法的準(zhǔn)確率不高，各項(xiàng)技術(shù)也各有利弊。在前期的研究中，我們應(yīng)用免疫磁珠負(fù)性篩選策略，成功在食管鱗癌患者外周血中富集、鑒定出食管鱗癌CTCs[6]，但由于步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，難以在臨床推廣應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，費(fèi)用較低、操作簡(jiǎn)便、快速、數(shù)據(jù)精確，更適于臨床普查，而且可在免疫放大檢測(cè)CTCs的同時(shí)對(duì)癌細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行定量測(cè)定，同時(shí)還可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，并可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析與分選。但缺點(diǎn)在于不能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，不能反映CTCs的功能狀態(tài)[13]。為提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度，本研究采用了密度梯度離心法和流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合檢測(cè)方法。

腫瘤細(xì)胞分解產(chǎn)物超出正常網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)的清除能力，胞內(nèi)細(xì)胞角蛋白水平大大升高并被釋放入血[14]，故針對(duì)細(xì)胞角蛋白的檢測(cè)常用于外周血CTCs的鑒定，本研究也選擇了EpCAM及CK作為CTCs的定性標(biāo)志，將標(biāo)記為CD45-/EpCAM+/CK+的細(xì)胞定義為CTCs。CTCs檢測(cè)結(jié)果受多種因素影響，本研究主要通過標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)步驟的優(yōu)化等減少假陰性、假陽(yáng)性結(jié)果。血樣采集時(shí)，將最初的2 mL外周血棄除，避免采血處皮膚等組織上皮細(xì)胞的混入。實(shí)驗(yàn)操作中，選用單克隆抗體，減少多克隆抗體的非特異染色，同時(shí)，在每次染色完成后，用PBS進(jìn)行洗滌，最大限度減少非特異染色對(duì)識(shí)別的干擾。研究結(jié)果顯示，5例健康志愿者外周血中CTCs定量均為陰性，而20例食管鱗癌患者中有15例CTCs定量為陽(yáng)性，CTCs陽(yáng)性率達(dá)到75%。提示此方法特異性、敏感度較高。

本研究的不足之處是樣本量較少，數(shù)據(jù)有限，在后續(xù)研究中將增加樣本量，并通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和隨訪數(shù)據(jù)的積累，繼續(xù)完善、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)一步評(píng)價(jià)該研究方法的臨床應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)嘗試通過血液富集將游離DNA 濃集，用流式分選將單個(gè)CTCs分離，為基因測(cè)序、DNA、RNA及蛋白分子等的分析奠定基礎(chǔ)。