郭倫鋒 劉鐵明 袁鷹 董明芝 謝艷華 王四旺

(1.安康市中心醫(yī)院藥劑科，陜西 安康 725000；2.西安正大制藥有限公司，陜西 西安 710043；3.西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710069)

胃和十二指腸功能紊亂可導(dǎo)致一系列消化道病癥[1]，稱為功能性消化不良(functinal dyspepsia，F(xiàn)D)。其主要病理機(jī)制是胃腸動(dòng)力障礙，常合并抑郁、焦慮、情緒異常等精神心理性障礙[2]。據(jù)胡柳丹等[3]報(bào)道，普通人群中約20%～40%伴發(fā)不同程度的FD。我國部分地區(qū)的FD患者在消化內(nèi)科門診就診患者中的比例高達(dá)50%[4]。秦艽是我國重要的傳統(tǒng)中藥材，其主要功效為祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛和退虛熱[5]。艽龍膠囊由秦艽的提取物制成，具有清肝泄熱的功效，用于功能性消化不良?，F(xiàn)代臨床及實(shí)驗(yàn)研究均表明，艽龍膠囊對(duì)FD具有良好療效，能明顯緩解患者的癥狀，提高胃腸消化能力[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，10批艽龍膠囊中含龍膽苦苷(約占百分比)、馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、山梔苷甲酯、獐芽菜苷、異葒草苷、異牡荊黃素的含量依次為483.760(65.0%)、104.337(15.0%)、49.291(6.5%)、8.304(1.1%)、7.170(1.0%)、5.124(0.7%)、0.885(0.1%)、0.608(<0.1%)mg/g；其中6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、馬錢苷酸和獐芽菜苦苷轉(zhuǎn)移率依次為87.23%～97.88%、81.47%～96.15%、48.90%～86.47%和21.34%～44.67%%[7]。有研究表明，中藥促進(jìn)胃動(dòng)力的作用機(jī)制可能與抑制FD大鼠胃竇組織細(xì)胞的自噬相關(guān)[8]；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)/磷酸化真核翻譯起始因子2α(eIF2α)信號(hào)通路調(diào)控自噬[9]；本研究旨在探討艽龍膠囊及其主要成分對(duì)FD大鼠治療作用，明確其治療FD的功效成分和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量180±20 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(軍)2012-0007。動(dòng)物在獨(dú)立換氣籠盒(IVC系統(tǒng))飼養(yǎng)，溫度22～26 ℃，濕度50%～70%，12 h光照/黑暗周期循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥物 艽龍膠囊(批號(hào)20170216K)由西安正大制藥有限公司提供；龍膽苦苷(純度98%，批號(hào)201703112)、馬錢苷酸(純度98%，批號(hào)201701201)、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(純度98%，批號(hào)201802093)、山梔苷甲酯(純度97%，批號(hào)201802103)均購于上海純優(yōu)生物科技有限公司；多潘立酮片(批號(hào)180511230，國藥準(zhǔn)字H10910003)，購自西安楊森制藥公司。

1.1.3試劑與儀器 PERK單克隆抗體，美國Novus公司；p-eIF2α單克隆抗體，美國CST公司；血清胃促生長素(Ghrelin，GH)和血管活性腸肽(VIP)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒，購自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司。Modle型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國Bio-Rad公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，Milli-Q Academic 超純水系統(tǒng)(Merck Millipore 集團(tuán)公司)，生物顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)(美國Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1造模及給藥 采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，除空白組外，其余組大鼠參照張鈺琴等方法[10]造模。即每日用包裹海綿的長鉗夾大鼠尾部末端1/3處，以不破皮為度，令其尖叫或與其他大鼠打斗，30 min/次，2次/d，每2次間隔至少8 h，持續(xù)4周。期間如有大鼠被抓傷，可用0.5%碘伏消毒受傷部位，以防感染。于造模第1天開始各組灌胃相應(yīng)藥物進(jìn)行治療，正常和模型組動(dòng)物灌胃等容量蒸餾水，1次/d，共4周。

1.2.2胃排空率和腸推進(jìn)率檢測(cè) 參照黃愛華[11]方法，大鼠末次給藥后禁食不禁水24 h，按15 mL/kg 體質(zhì)量灌胃營養(yǎng)半固體糊(組成：羧甲基纖維素鈉10 g、全脂奶粉16 g、糖8 g、淀粉8 g、蒸餾水200 mL、1 mL碳素墨水)，30 min后，10%水合氯醛麻醉，背臥位固定于鼠板上，腹主動(dòng)脈采血。結(jié)扎賁門和幽門，取完整胃，濾紙吸干稱取量全胃重量，沿胃大彎剪開胃壁并用生理鹽水沖洗干凈胃壁，濾紙吸干，稱取重量為空胃重。取出小腸在白紙上擺直，檢測(cè)小腸的總長度L(自幽門到回盲部距離)和碳末推進(jìn)的距離L0(自幽門到碳末推進(jìn)的前端距離)，按照如下公式計(jì)算胃排空率和腸推進(jìn)率。胃排空率(%)=[1-(全胃重-空胃重)/總灌胃量]× 100%；腸推進(jìn)率(%)=L0 /L×100%。

1.2.3血清中GH及VIP檢測(cè) 血樣在室溫靜置3 h，3 000 r/min離心15 min，分離上層血清。按照ELISA試劑盒中檢測(cè)步驟對(duì)血清中GH和VIP含量進(jìn)行檢測(cè)。將標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣品加入96孔板中，與一抗共同孵育1.5 h，倒出板內(nèi)液體，洗板5次，加入二抗繼續(xù)孵育30 min，孵育結(jié)束洗板3次，加入顯色劑15 min后加反應(yīng)終止液，酶標(biāo)儀測(cè)吸光度，計(jì)算得出GH和VIP含量。

1.2.4胃竇組織中PERK、p-eIF2α蛋白檢測(cè) 取出凍存于-80 ℃冰箱的胃竇組織，稱量1.0 g，眼科剪剪碎成細(xì)末狀，加入十倍體積的組織裂解液，按比例加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，置冰上反復(fù)研磨，提取組織中總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，加入上樣緩沖液，置沸水中煮5 min，凍存于-80 ℃冰箱，Western blot(WB)檢測(cè)PERK、p-eIF2α蛋白含量。配膠試劑盒配置分離膠和濃縮膠，待充分凝固后，加入提取的蛋白樣品，初始恒壓80V電泳30 min，待marker分開即轉(zhuǎn)為120 V恒壓至電泳結(jié)束。200 mA恒流濕轉(zhuǎn)2.5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，洗膜，一抗4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜，室溫孵育二抗2 h，洗膜后化學(xué)成像發(fā)光儀進(jìn)行顯影，分析軟件計(jì)算灰度值，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)用(meanSD)方式表示，檢驗(yàn)前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若服從正態(tài)分布且方差齊性，則用參數(shù)檢驗(yàn)中的One-way ANOVA分析，若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的獨(dú)立樣本分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各試藥對(duì)大鼠胃排空率和腸推進(jìn)率的影響 與正常組比較，模型組大鼠胃排空率和腸推進(jìn)率降低(P<0.01)；與模型組比較，艽龍膠囊、龍膽苦苷和山梔苷甲酯組大鼠胃排空率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，艽龍膠囊和龍膽苦苷組大鼠腸推進(jìn)率與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，山梔苷甲酯組改善作用雖不及艽龍膠囊組，但仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而馬錢苷酸及6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷組對(duì)胃排空率和腸推進(jìn)率無影響，見表1。

表1 各組的胃排空率和腸推進(jìn)率

注：與正常組比較，△P<0.01；與模型組比，*P<0.05，#P<0.01。

2.2各試藥對(duì)血清中GH和VIP水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中GH含量降低，而VIP含量升高(P<0.01)；與模型組比較，艽龍膠囊和龍膽苦苷能升高血清中GH水平同時(shí)降低VIP含量(P<0.01)，山梔苷甲酯也能一定程度的升高GH和降低VIP含量(P<0.05)。此外，與模型組比較，馬錢苷酸及6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷雖對(duì)血清中GH含量無影響，但能降低血清中VIP的含量(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清中GH和VIP含量

注：與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.3各試藥對(duì)胃竇組織中PERK、p-eIF2α蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組胃竇組織中PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組相比，艽龍膠囊及其主要成分龍膽苦苷和馬錢苷酸能夠降低胃竇組織中PERK蛋白表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，而6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷和山梔苷甲酯對(duì)PERK蛋白表達(dá)無顯著影響(P>0.05)；與模型組相比，艽龍膠囊及其主要成分龍膽苦苷能降低p-eIF2α蛋白表達(dá)(P<0.01)，山梔苷甲酯組的p-eIF2α蛋白含量與模型組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而馬錢苷酸及6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷對(duì)p-eIF2α蛋白表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。見圖1。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1各組大鼠胃竇組織中PERK和p-eIF2α蛋白含量

3 討 論

FD在我國的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)代研究認(rèn)為FD發(fā)病多與胃腸功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)有關(guān)[12]。胃腸激素是影響胃腸動(dòng)力的重要因素，其中GH作為一種生長激素促分泌素受體的配體蛋白，主要分布于胃腸道，作為垂體—下丘腦—胃腸道的媒介，參與機(jī)體的能量代謝、胃腸消化蠕動(dòng)和內(nèi)分泌等過程，具有促進(jìn)攝食的作用[13]。VIP蛋白是一種舒血管腸肽，能夠調(diào)節(jié)平滑肌和腺體分泌，從而抑制性調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力，在消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等多個(gè)組織均有分布[14]。

Daidoo等[15]證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是感應(yīng)微妙環(huán)境變化、細(xì)胞壓力、協(xié)調(diào)信號(hào)通路、調(diào)控細(xì)胞功能及細(xì)胞存活的重要細(xì)胞器。所以，機(jī)體蛋白過度突變、病毒感染、能量營養(yǎng)缺乏等均可損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白的大量聚集，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；PERK/eIF2α信號(hào)通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下最先激活的一條重要通路。有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)時(shí)間過長或者過度時(shí)，PERK/eIF2α信號(hào)通路則無法恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，促使細(xì)胞走向自噬[16]。由此可見PERK的激活和p-eIF2α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在的重要標(biāo)志物。

我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D大鼠血清中GH含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常組，血清中VIP含量和胃竇組織內(nèi)PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)均顯著升高，說明FD大鼠模型成功建立。艽龍膠囊及其主成分即龍膽苦苷和和山梔苷甲酯干預(yù)后，F(xiàn)D大鼠血清中GH含量升高，VIP含量及胃竇組織內(nèi)PERK和p-eIF2α表達(dá)均顯著降低，表明艽龍膠囊治療FD的功效與其顯著促進(jìn)FD大鼠胃排空和腸推進(jìn)的作用，促進(jìn)GH分泌，抑制VIP水平，同時(shí)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路PERK/eIF2α有關(guān)。

艽龍膠囊是臨床證實(shí)對(duì)治療FD具有顯著療效的中藥制劑，其主要成分是秦艽提取物，經(jīng)本課題組前期研究證實(shí)，大鼠給予一定劑量的艽龍膠囊后，在血漿及重要臟器組織中可以檢測(cè)到龍膽苦苷、馬錢苷酸、山梔苷甲酯、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷和獐牙菜苷等成分，且在60 min時(shí)即可達(dá)到較高的濃度，其中胃腸道中各有效成分的含量均較高。本研究結(jié)果顯示，艽龍膠囊及其主成分龍膽苦苷和山梔苷甲酯在促進(jìn)FD大鼠的胃排空率、腸推進(jìn)率和升高血清中GH水平，降低血清VIP和胃竇組織中PERK蛋白及p-eIF2α蛋白表達(dá)水平方面，均表現(xiàn)出與艽龍膠囊和多潘立酮非常一致的作用，由此說明，龍膽苦苷和山梔苷甲酯是艽龍膠囊治療FD的主要功效成分。