侯雷 元曉龍 馬武開Δ 姚血明 陸道敏 寧喬怡 曾蘋 周靜

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003；2.林州市人民醫(yī)院，河南 林州 456550)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性進展性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)以對稱性、侵蝕性及多關(guān)節(jié)炎為主要特點，其基本病理表現(xiàn)為滑膜炎及血管翳的形成。RA是臨床上常見的難治性風(fēng)濕類疾病，在我國的發(fā)病率為0.42%，且致殘率較高[1]。RA具體的發(fā)病機制仍不清楚，目前較為一致的觀點認為，RA的發(fā)病與體內(nèi)輔助性T細胞17(helper T cells 17，Th17)及白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)的表達有關(guān)[2-3]。Th17細胞是機體中一種新型的輔助性T細胞，是導(dǎo)致RA發(fā)生的關(guān)鍵性免疫應(yīng)答細胞，而IL-17是Th17細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要效應(yīng)因子，具有強大的致炎作用[4-5]。臨床上觀察RA患者常用判斷病情的活動指標是28個關(guān)節(jié)疾病活動度評分(disease activity score-28，DAS28)，但RA患者DAS28評分不同活動度與Th17細胞及IL-17之間關(guān)系的研究卻很少。因此，本研究通過觀察RA患者28個關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腫脹數(shù)(swollen joint count，SJC)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)(tender joint count，TJC)、疼痛視覺模擬評分(Visual Analogue Score，VAS)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)來計算DAS28評分，探討其與RA外周血中Th17細胞及IL-17的相關(guān)性，以期為RA的臨床治療及IL-17靶向藥物的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 RA患者120例均選取于2017年6月至2017年12月在我院風(fēng)濕科住院期間確診的患者，其中男9例，女111例，年齡18～70歲，平均年齡(52.32±10.17)歲，病程1月～26年，平均(59.73±11.28)月。健康對照組30名均來源于同期在我院體檢中心體健的健康人群，其中男11例，女19例，年齡18～60歲，平均年齡(46.25±14.55)歲。納入標準：RA組：符合2010年ACR/EULAR聯(lián)合制定的RA分類診斷標準；年齡在18～70歲；未伴有其它風(fēng)濕免疫性疾病者；患者知情同意。健康對照組：實驗室檢測各項指標均在正常范圍內(nèi)，且無慢性疾病史者。排除標準：不符合上述RA納入標準者；伴有急慢性感染和惡性腫瘤者；伴有嚴重肝腎功能不全和心腦血管疾病者。

1.2診斷標準 120例RA患者均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(ACR/EULAR)聯(lián)合制定的RA診斷分類標準[6]。

1.3臨床觀察指標 制作RA患者臨床指標觀察表，包括28個關(guān)節(jié)的SJC、TJC，VAS，ESR；運用DAS28-ESR公式計算DAS28評分[7]，并根據(jù)DAS28評分分為緩解期組17例(DAS28≤2.6)、低度活動組22例(2.65.1)。

1.4實驗試劑及儀器 人淋巴分離液、無菌PBS緩沖液、流式染色緩沖液、人IL-17酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(以上均購自昆明綠盟科技有限公司)；Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human IL-17A單克隆抗體、同型陰性對照Alexa Fluor 647 Mouse IgG1 K Isotype control抗體、FITC Mouse Anti-Human CD3單克隆抗體、破膜劑Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO、刺激阻斷劑Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug、PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD8單克隆抗體(以上均購自美國BD公司)。BD FACSCanto II型流式細胞儀(購自美國BD公司)；酶標分析儀、洗板機(均購自深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司)；臺式低速離心機(購自長沙平凡儀器儀表有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(購自上海華連醫(yī)療器械公司)；電熱恒溫水浴箱(購自北京醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.5流式細胞術(shù)(FCM)檢測外周血中Th17細胞表達的百分率 取2 mL新鮮肝素抗凝血與2 mL 無菌PBS緩沖液混勻置入無菌流式管中，再加人淋巴分離液4 mL，4 ℃避光2 000 r/min，離心20 min，吸取中間乳白色樣單核細胞層(PBMC)，加無菌PBS緩沖液配置成250 μL PBMC；加2 μL 250x刺激阻斷劑，混勻，5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)4 h；加20 μL FITC-CD3單克隆抗體及5 μL PerCP-CD8單克隆抗體，混勻，室溫避光30 min；加1 mL 破膜劑，混勻，室溫避光30 min；加1 mL無菌PBS緩沖液，混勻，4 ℃避光1 500 r/min，離心5 min，棄上清；再加1 mL無菌PBS緩沖液，混勻，將細胞液平均分為兩管，分別加Alexa Fluor - IL-17A單克隆抗體、同型陰性對照Alexa Fluor- IgG1 K抗體20 μL ，4 ℃ 避光30 min后加流式染色緩沖液1 mL，4 ℃避光1 500 r/min，離心5 min，棄上清；重復(fù)洗滌2次后加無菌PBS緩沖液500 μL，充分重懸后上流式細胞儀檢測分析Th17細胞(CD3+CD8-IL-17+)表達的百分率。

1.6ELISA法檢測血清IL-17表達的濃度 清晨空腹采集外周靜脈血5 mL，采集后3 000 r/min離心10 min分離血清，置于無菌EP管-20 ℃冰箱保存?zhèn)錂z；檢測時嚴格按照人IL-17酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒說明書上的步驟檢測血清IL-17表達的濃度。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 RA患者不同分組間在性別、年齡及病程上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

表1 不同分組間性別、年齡、病程的關(guān)系

注：不同RA分組間兩兩相比，P均>0.05。

2.2不同RA分組間SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28的比較 SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28在各組中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28由高到低依次為：高度活動組>中度活動組>低度活動組>緩解期組，見表2。

表2 不同RA分組間SJC/TJC/VAS/CRP/DAS28的比較

注：不同RA分組間兩兩相比，P均<0.05。

2.3不同分組間Th17細胞、IL-17表達水平的比較 與健康對照組比較，RA患者各組Th17細胞、IL-17表達水平均明顯升高，且兩兩組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P均<0.05)。Th17細胞、IL-17的表達水平依次為高度活動組>中度活動組>低度活動組>緩解期組>健康對照組，見圖1-8、見表3。

表3 不同分組間Th17細胞、IL-17表達水平的比較

注：不同分組間兩兩相比，P均<0.05。

2.4不同RA分組間Th17細胞、IL-17表達水平與DAS28評分的相關(guān)性 結(jié)果顯示：緩解期組、低度活動組、中度活動組及高度活動組與RA患者外周血中Th17細胞及IL-17表達水平均呈正相關(guān)關(guān)系，見表4。

表4 不同RA分組間Th17細胞、IL-17表達水平與DAS28評分的相關(guān)性

3 討 論

RA是由多種炎癥因子共同參與，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜增生和血管翳形成，對關(guān)節(jié)滑膜及軟骨造成侵犯破壞的無菌性炎癥反應(yīng)疾病，并最終可引起關(guān)節(jié)畸形及活動明顯受限，從而嚴重影響RA患者的日常生活質(zhì)量。至今RA的發(fā)病具體機制還不完全清楚，但最新的研究提示RA患者外周血中T淋巴細胞亞群變化異常往往是其發(fā)病的重要原因。例如，研究發(fā)現(xiàn)RA的發(fā)病與體內(nèi)Th17細胞及IL-17的表達有關(guān)，在大量小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的研究中表明：Th17細胞效應(yīng)因子IL-17具有很強的致炎作用，是RA發(fā)病的重要原因[8-10]。

Th17細胞是機體中一種新型的輔助性T細胞，主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、IL-23和TNF-α等細胞因子，但以分泌IL-17為主要特征。IL-17是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個白介素家族成員，主要是由活化的記憶性CD4+T淋巴細胞亞群分泌而來[11-12]，尤以Th17細胞分泌IL-17A為主，其參與了RA的發(fā)病及病情進展，并具有強大的致炎作用，因此成為一個研究的熱點[13-15]。已有研究明確IL-17可以誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α及IL-1、IL-6等炎癥因子，這些炎癥因子可以促進并激發(fā)Th17細胞的活化，從而加大炎癥反應(yīng)的表達[16]。IL-17還能夠促進破骨細胞和滑膜成纖維細胞的活化和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17能刺激RA 患者外周血單核細胞向破骨細胞分化，健康人外周血CD4+單核細胞經(jīng)巨噬細胞集落刺激因子和IL-17共同刺激后，其向破骨細胞分化的能力及破骨細胞的活性均明顯增強，抑制IL-17治療后，破骨細胞的數(shù)量減少且骨破壞減輕[17-18]。這些研究說明，Th17細胞及IL-17在促進炎癥和骨破壞方面發(fā)揮著重要作用。

DAS28評分是臨床上觀察RA患者病情的活動指標，能有效客觀的評價患者的病情程度；目前臨床上常常作為RA患者疾病活動度和經(jīng)藥物治療后是否有效的評估指標。本研究結(jié)果顯示，SJC、TJC、VAS、ESR及DAS28在各組中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；另外，肖盼盼等[19]、崔潞萍等[20]報道SJC、TJC、VAS、ESR水平的升高與RA的病情活動指標呈DAS28評分正相關(guān)，提示DAS28評分在臨床上可作為RA患者療效觀察及評價和預(yù)后判斷的臨床常用病情監(jiān)測指標。我們依據(jù)DAS28-ESR評分將RA患者進行分組，比較四組間與健康對照組外周血中Th17細胞數(shù)量和血清IL-17的表達水平。本研究結(jié)果顯示，RA患者各組與健康對照組相比，RA患者外周血中Th17細胞數(shù)量和血清IL-17表達水平均有明顯升高，同時兩兩組間相比較其表達水平隨疾病活動度的輕重逐漸升高且差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，提示Th17細胞及IL-17兩者均參與了RA的炎性發(fā)病過程，這與肖盼盼等[19]、車昌燕等[21]、張力力等[22]報道的研究結(jié)果相一致。RA患者各組與DAS28評分進一步Pearson相關(guān)性分析顯示，RA患者各組外周血中Th17細胞數(shù)量和血清IL-17表達水平與DAS28評分均呈正相關(guān)性，這與曹艷玲等[23]報道的研究結(jié)果相一致，提示Th17細胞及IL-17參與了RA的炎癥反應(yīng)，且兩者的表達率越高，RA患者的疾病活動度越重。

綜上所述，Th17細胞及其效應(yīng)因子IL-17具有很強的致炎和骨破壞作用，目前大量研究已經(jīng)證實Th17細胞及其效應(yīng)因子IL-17參與多種自身免疫性炎性疾病的發(fā)生及病情的進展。通過本研究我們可以進一步證實：Th17細胞及其效應(yīng)因子IL-17在RA發(fā)病炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，并且兩者與DAS28評分之間存在明顯的正相關(guān)性關(guān)系，臨床上聯(lián)合檢測兩者也有助于評估RA患者的疾病活動度。因此，我們可以推測：針對Th17細胞及IL-17的靶向生物制劑的研發(fā)，可以有效地減輕RA患者關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)及疾病活動度，為RA的治療領(lǐng)域提供新的研究方向并具有廣闊的應(yīng)用前景[24]。

(圖1—8見封三)