謝易 李彬彬 龔泰芳

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院骨科，湖北 十堰 442000)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)的特征是惡性細(xì)胞直接形成未成熟的骨或類骨組織，被認(rèn)為起源于間充質(zhì)干細(xì)胞，常見于兒童和成人[1]。根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的最新估計(jì)，在所有新癌癥病例中，OS占0.2%(3260)，在2018年，OS占癌癥死亡的0.3%(1550)[2]。磁共振、新輔助化療、外科手術(shù)等是OS診斷和治療的主要方法，但由于侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(主要是肺轉(zhuǎn)移)，總生存率仍然很低，治療OS需要新的有效可靠的方法和靶點(diǎn)。因此，闡明骨肉瘤的分子機(jī)制對(duì)于開發(fā)新的治療策略以改善患者的預(yù)后至關(guān)重要。尋找早期診斷和評(píng)估骨肉瘤預(yù)后的分子靶點(diǎn)具有重要意義。ZNF139基因是目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑癌基因，在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥性等機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[3-6]，但在骨肉瘤中的研究尚不清楚。本研究通過驗(yàn)證ZNF139在人骨肉瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，以及ZNF139基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制，以期揭示其對(duì)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞：骨肉瘤細(xì)胞系(143B、MG-63、U2OS和HOS)以及正常人成骨細(xì)胞hFOB1.19 購(gòu)自上海生科所生物細(xì)胞庫(kù)；試劑：1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibico 公司、CCK-8 試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司、酶聯(lián)蛋白V(AnnexinV)/碘化丙啶(PI)染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司、六孔板、96孔板購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司、實(shí)驗(yàn)用一抗購(gòu)自美國(guó) CST 公司、實(shí)驗(yàn)用二抗購(gòu)自美國(guó) CST 公司、PVDF膜購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司、Cocktail 試劑購(gòu)自美國(guó)羅氏試劑公司。

1.2儀器和臨床組織樣本 實(shí)驗(yàn)中所用的儀器(細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱、RNA濃度測(cè)量?jī)x器Landdrop、qPCR儀、酶標(biāo)儀等)均由湖北醫(yī)藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供和使用。Tranwsell小室和基質(zhì)膠(美國(guó)Millipo)。ZNF139 基因引物由天津金唯智有限公司設(shè)計(jì)并合成；收集我科2010年1月至2017年1月治療的29例骨肉瘤患者的腫瘤樣本，以鄰近正常組織樣本和病理資料。本研究得到了我院的倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，組織標(biāo)本診斷由我院病理科高年資醫(yī)師診斷。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞和組織RNA和蛋白提取 骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞的RNA和蛋白以及上述臨床樣本中RNA和蛋白提取步驟同已有的文獻(xiàn)報(bào)道[7]。提取后RNA在Landdrop儀器中測(cè)得濃度，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，實(shí)驗(yàn)方法及步驟參考樣品實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書及已有的參考文獻(xiàn)[13]。將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA放于-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2qRT-PCR檢測(cè)ZNF139在骨肉瘤中的表達(dá) qRT-PCR 的步驟同試劑盒使用說(shuō)明書和文獻(xiàn)所述[15]。ZNF139-F：5’-GACTGGAAGAAGCTGCTGCTAA-3’，ZNF139-R：5’-CTGACGTCTCCACAGCACTCACT-3’。使用 HT7500 生物系統(tǒng)以及 SYBR?Green的試劑盒。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR 擴(kuò)增，選擇β-actin為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)；用2-△△Ct法對(duì)樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對(duì)定量分析，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量，擴(kuò)增指數(shù)越高，相對(duì)表達(dá)越高。

1.3.3qRT-PCR檢測(cè)ZNF139在骨肉瘤中的表達(dá) ZNF139過表達(dá)質(zhì)粒載體購(gòu)買于天津金唯智生物科技有限公司。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法和步驟同參考文獻(xiàn)[8]，活性狀態(tài)下的骨肉瘤細(xì)胞143B種于在六孔板中，轉(zhuǎn)染載體：Lipofectamine-2000(美國(guó)通用應(yīng)力公司)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的功能實(shí)驗(yàn)。

1.3.4CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZNF139基因過表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響 CCK-8法：上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞48 h后取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)，3 000 細(xì)胞/100 μL 1 640 培養(yǎng)液細(xì)胞加入96孔板中放于細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)約24 h；待細(xì)胞完全貼壁后，每孔加入20 μL的CCK8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，使用酶標(biāo)儀(480 nm)測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的吸光度，然后統(tǒng)計(jì)作圖?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染 48 h后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組計(jì)數(shù)，取1 000個(gè)細(xì)胞/100 μL 1 640培養(yǎng)液的細(xì)胞加入六孔板中，將六孔板放于37 ℃，5% CO2的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)二周，當(dāng)細(xì)胞形成集落克隆團(tuán)后，多聚甲醛固定、染色并計(jì)數(shù)，然后統(tǒng)計(jì)作圖。

1.3.5流式細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn) 流式細(xì)胞周期的方法同參考文獻(xiàn)[9]。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞48 h后取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)，收集并使用多聚甲醛4 ℃進(jìn)行固定約24 h，避光下使用PI染色，并送流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)作圖。細(xì)胞凋亡：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，Binding 緩沖液重懸，分別加入V-fluorescein 和碘化丙錠(PI)混勻，避光30 min，送流式細(xì)胞儀分析，統(tǒng)計(jì)作圖。

1.3.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移和侵襲的影響 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)：收集上述實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨肉瘤143B細(xì)胞，消化離心后并重懸；倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，取4×103個(gè)細(xì)胞/孔種于 transell小室上室，下室加入10% 1 640培養(yǎng)液約700 μL，放入細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)；待24 h后取出小室，固定，染色，計(jì)數(shù)(顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野)；計(jì)數(shù)并評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前在transwell小室上室中加入基質(zhì)膠(無(wú)血清1 640培養(yǎng)液：基質(zhì)膠=1∶5)混勻，基質(zhì)膠小室放入細(xì)胞孵育箱中約2～4 h，待基質(zhì)膠凝固后進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn); 侵襲實(shí)驗(yàn)步驟基本同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.7免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)143B在細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)：收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，提取細(xì)胞蛋白后測(cè)定蛋白濃度[10]。取50 μg/孔細(xì)胞蛋白進(jìn)行凝膠電泳，常溫下將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上，5%脫脂牛奶的TBST室溫下封閉2 h，加入一抗及內(nèi)參GAPDH(美國(guó)Abcam公司)，4 ℃凍庫(kù)封閉過夜。24 h后常溫下復(fù)溫約30 min，TBST液洗膜后，二抗封閉液室溫下?lián)u床孵育2 h，顯色劑(DAB)顯色、成像儀曝光，并用 Quantity One 軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH之比來(lái)表示相對(duì)表達(dá)差異。

2 結(jié) 果

2.1ZNF139 在骨肉瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá) 半定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常成骨細(xì)胞相比，ZNF139 mRNA蛋白在骨肉瘤細(xì)胞系143B、MG-63、U2OS和HOS中低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1A；同時(shí)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，在配對(duì)的腫瘤組織中，與癌旁組織相比，ZNF139 mRNA的水平在骨肉瘤中表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1B。免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與正常成骨組織比，ZNF139 蛋白在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào)(P<0.001)，見圖1C。

注：(A)ZNF139 mRNA在骨肉瘤細(xì)胞系中低表達(dá)，***P<0.001;(B)ZNF139 mRNA在骨肉瘤組織中低表達(dá)，***P<0.001;(C)ZNF139 蛋白在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào)，P<0.001。

圖1ZNF139在骨肉瘤細(xì)胞系和組織中的表達(dá)

2.2過表達(dá) ZNF139 基因?qū)σ种颇[瘤細(xì)胞增殖的影響 為驗(yàn)證ZNF139是否為功能性抑癌基因參與骨肉瘤進(jìn)展，我們對(duì)骨肉瘤143B進(jìn)行ZNF139的過表達(dá)，免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ZNF139的過表達(dá)(圖2A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組143B細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF139后，24h、48h和72h后細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01)，見圖2B；克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組143B細(xì)胞克隆形成的效率(31.23%±4.18%)下降(P<0.001)，見圖2C。

注：(A)免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ZNF139在143B中的過表達(dá)；(B)CCK-8實(shí)驗(yàn)ZNF139抑制細(xì)胞活性，P<0.01；(C)平板克隆顯示ZNF139 在抑制細(xì)胞克隆的形成，***P<0.001。

圖2ZNF139過表達(dá)對(duì)抑制骨肉瘤細(xì)胞143B增殖的影響

2.3恢復(fù)表達(dá)ZNF139基因?qū)?xì)胞周期及凋亡的影響 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：骨肉瘤細(xì)胞143B過表達(dá)ZNF139后，細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯；與對(duì)照組(28.18%±3.12%)相比，實(shí)驗(yàn)組中G1期細(xì)胞百分比明顯增加(45.68%±4.92%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖3A；同時(shí)凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細(xì)胞143B過表達(dá)ZNF139后，細(xì)胞明顯發(fā)生凋亡，凋亡細(xì)胞增加(14.29%±5.14%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖3B。

注：(A)ZNF139過表達(dá)后使143B細(xì)胞阻滯于G1期，***P<0.001；(B) ZNF139過表達(dá)后促進(jìn)143B細(xì)胞凋亡，***P<0.001。

圖3過表達(dá)ZNF139對(duì)細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)凋亡的影響

2.4過表達(dá)ZNF139 基因?qū)δ[瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)穩(wěn)定過表達(dá) ZNF139 以及轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)的143B細(xì)胞的遷移能力；結(jié)果發(fā)現(xiàn)：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-ZNF139 實(shí)驗(yàn)組穿過小室細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組 pcDNA3.1(+)-Vector 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖4。

注：與對(duì)照組比較，***P<0.001。

圖4ZNF139過表達(dá)對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.5過表達(dá)ZNF139對(duì)p53信號(hào)通路的影響 通過蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)過表達(dá)ZNF139后對(duì)p53及下游靶基因的影響，結(jié)果顯示：過表達(dá)ZNF139后，p53激活上調(diào)及下游周期相關(guān)靶基因p21和p27的表達(dá)上調(diào)(P<0.001)，見圖5A、5B；同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白BAX和Claeaved-Casp3表達(dá)上調(diào)(P<0.001)，見圖5A、5B。

注：(A)Western blotting 分析過表達(dá)ZNF139對(duì)p53信號(hào)通路的影響；(B)蛋白灰度分析ZNF139對(duì)p53信號(hào)通路相關(guān)靶點(diǎn)的影響，兩組比較，***P<0.001。

圖5ZNF139 過表達(dá)后對(duì)p53信號(hào)通路的影響

3 討 論

骨肉瘤是原發(fā)性骨惡性腫瘤死亡的主要原因，主要發(fā)生在青少年和兒童。根據(jù)癌癥統(tǒng)計(jì)，骨和關(guān)節(jié)惡性腫瘤占青少年和兒童癌癥死亡總數(shù)的8.9%[15]。文獻(xiàn)報(bào)告中：骨肉瘤手術(shù)切除患者的長(zhǎng)期生存率僅為20%[16]。目前，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療大大改善了骨肉瘤患者的預(yù)后，5年無(wú)轉(zhuǎn)移總生存率為60～70%[17]。然而，化療耐藥性仍是困擾骨肉瘤臨床治療的主要問題。近幾十年來(lái)，越來(lái)越多的研究開始致力于骨肉瘤的靶向治療；希望通過尋找到有效的治療靶點(diǎn)用于骨肉瘤的早期診斷與治療。鋅指蛋白(ZFPs)是脊椎動(dòng)物基因組家族中最大的轉(zhuǎn)錄因子；大約三分之一的ZFP包含了與Krüppel相關(guān)的KRAB結(jié)構(gòu)，超過一半ZFPS聚集在染色體19q13區(qū)域。ZFPs在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化和腫瘤發(fā)生中起重要作用。而ZFPs在骨肉瘤中作用的報(bào)道非常少見。ZNF139的cDNA為6.4 kb，編碼360個(gè)氨基酸；這種蛋白質(zhì)在從大鼠到人的不同脊椎動(dòng)物物種的進(jìn)化過程中高度保守；已有文獻(xiàn)報(bào)道其在組織器官發(fā)育，腫瘤形成中起著重要的作用，但在骨肉瘤中的作用尚不清楚。

本研究中我們首先檢測(cè)了ZNF139 在骨肉瘤細(xì)胞系和組織中的相對(duì)表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)，與成骨細(xì)胞相比，ZNF139 mRNA在骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)；在配對(duì)的臨床樣本組織中，ZNF139 mRNA和蛋白在骨肉瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)，其可能作為潛在的抑癌基因參與骨肉瘤的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，ZNF139能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制和促進(jìn)凋亡來(lái)抑制細(xì)胞的增殖；通過transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Flag-ZNF139質(zhì)粒后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下調(diào)；因此進(jìn)一步提示ZNF139作為功能性抑癌基因參與骨肉瘤的生物學(xué)進(jìn)程。

p53在調(diào)控細(xì)胞周期和DNA損傷修復(fù)中起著關(guān)鍵作用，并且抑制正常細(xì)胞發(fā)展為惡性表型[18]。此外，腫瘤抑制蛋白p53是凋亡途徑的重要組成部分，BCL2和BAX都是p53的重要轉(zhuǎn)錄靶基因；BCL2和BAX能影響線粒體細(xì)胞膜凋亡方式[19]。在本研究中，ZNF139增加了p53的轉(zhuǎn)錄和p53下游靶基因如：p21、p27和BAX等的表達(dá)；進(jìn)一步提示ZNF139通過激活p53信號(hào)通過參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上，本研究顯示ZNF139基因在骨肉瘤組織中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)ZNF139后能通過激活p53信號(hào)通路來(lái)調(diào)控骨肉瘤的進(jìn)展。但ZNF139在組織和細(xì)胞系表達(dá)與臨床預(yù)后，以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中是否作為抑癌基因參與腫瘤進(jìn)展尚需要進(jìn)一步的研究。