張偉珍， 段廷玉

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院/蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730020)

豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)又稱豆蚜，是半翅目蚜科昆蟲[1]。該類昆蟲在世界各地分布十分廣泛，可危害包括豌豆(Pisumsativum)、苜蓿(Medicagosativa)、三葉草(Trifoliumsubterraneum)等在內(nèi)的多種豆科作物及牧草，是豆科作物種植及牧草栽培的主要害蟲之一[2]。豌豆蚜多聚集在豆科植物的的嫩莖、嫩葉及幼芽等部位，以其刺吸式口器刺穿植物表皮吸取汁液，造成植株體內(nèi)營養(yǎng)流失，葉片卷縮、凋零，花蕾變黃脫落，嚴(yán)重時(shí)田間植株成片枯死，造成重大產(chǎn)量損失[3-4]。此外，豌豆蚜取食植物還可以傳播多種植物病毒，是三葉草、苜蓿等植物病毒病的主要傳播媒介之一[5]。

箭筈豌豆(Viciasativa)是雙子葉植物綱薔薇目豆科野豌豆屬植物，一年生或越年生[6]。箭筈豌豆具有早發(fā)、速生、早熟、產(chǎn)種量高而穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且其營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，莖葉含粗蛋白22.81%、有機(jī)物含量81.56%，含氮2.30%、含磷0.20%、含鉀1.58%，是一種優(yōu)良牧草[7]。近年來綠肥產(chǎn)業(yè)興起，箭筈豌豆作為西北干旱地區(qū)的一種重要的豆科綠肥作物，可與小麥、燕麥等進(jìn)行輪作、套作或混播，對增加土壤有機(jī)質(zhì)，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力具有重要作用[8-9]。蟲害是牧草產(chǎn)業(yè)中除病害外另一個(gè)極其重要的限制因子，據(jù)調(diào)查，蟲害不僅會(huì)導(dǎo)致牧草生長發(fā)育不良，嚴(yán)重的還會(huì)出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)甚至全株死亡，降低牧草的適口性，嚴(yán)重影響家畜取食；同時(shí)，蟲害還會(huì)引起牧草產(chǎn)量下降，營養(yǎng)價(jià)值降低，制約牧草生產(chǎn)，引起重大經(jīng)濟(jì)損失[10]。豌豆蚜是箭筈豌豆上的一種重要害蟲，在甘肅夏河的箭筈豌豆栽培區(qū)中發(fā)生面積較廣、蟲口密度較大，且因其天敵數(shù)量少，極易造成蟲害發(fā)生蔓延，應(yīng)及早采取防治措施，以免對箭筈豌豆種植業(yè)造成損失。

叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal，AM)真菌是球囊菌門(Glomeromycota)真菌，廣泛存在于自然界中[11]。AM真菌、昆蟲同時(shí)作用于植物體，可形成AM真菌-植物-昆蟲互作體系[12-13]。已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌可通過調(diào)控植物的生長、生理生化代謝以及基因表達(dá)等，進(jìn)而調(diào)控植物與昆蟲的互作效應(yīng)[14-15]。一些球囊霉屬的真菌可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量揮發(fā)性化合物，主要是萜烯類、醇類、酯類和少量烷烴類物質(zhì)，通常這類物質(zhì)是作為植物-昆蟲營養(yǎng)關(guān)系中信息傳遞的媒介，可以影響到昆蟲的取食偏好及種群動(dòng)態(tài)[16]。AM真菌侵染植物后產(chǎn)生的毒性代謝物，如E-2-己烯-1-醇、芳樟醇、苯甲醛、香芹酚等，這些物質(zhì)對害蟲具有抑制或毒殺效果，可以保護(hù)植物，減少昆蟲取食，提高植物抗蟲性[17-18]；另外AM真菌也可通過強(qiáng)大的菌絲網(wǎng)絡(luò)在鄰近植株間傳遞抗蟲防御信號[19-20]，因此在害蟲防治方面應(yīng)用前景十分廣泛。本研究選用箭筈豌豆作為宿主植物，研究AM真菌對豌豆蚜生長、植株代謝的影響，以期為利用AM真菌減少豌豆蚜對箭筈豌豆的危害、促進(jìn)其天敵和有益昆蟲的發(fā)生、增創(chuàng)生態(tài)系統(tǒng)效益提供理論及技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試植物 蘭箭3號春箭筈豌豆(Viciasativacv. Lanjian No.3)。

1.1.2供試?yán)ハx 豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)，采集自蘭州大學(xué)榆中苜蓿試驗(yàn)田，形態(tài)學(xué)鑒定，以豌豆幼苗作為寄主，于光照培養(yǎng)箱(每天光照時(shí)間為14 h，黑暗時(shí)間為10 h；溫度為20±1℃；濕度為60% RH)中培養(yǎng)，用得到的2齡若蚜作為接種昆蟲。

1.1.3供試土壤 試驗(yàn)用土由兩部分組成，黑土和沙土，購自蘭州花市。所有基質(zhì)過2 mm篩，121℃高壓滅菌兩次，每次滅菌1 h，間隔24 h。再將黑土∶沙土以1∶3的比例混合?；旌贤寥阑|(zhì)全N為16.21 mg·kg-1，全P為17.18 mg·kg-1，pH為7.3。

1.1.4供試菌劑 供試AM真菌菌劑為扭形球囊霉(Glomustortuosum)。購買于北京市農(nóng)林科學(xué)研究院植物營養(yǎng)與資源研究所，中國叢枝菌根真菌菌種資源保藏中心，宿主植物為三葉草(Trifoliumsubterraneum)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)于2018年8月-10月在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院智能溫室進(jìn)行。2種AM真菌接菌處理：接菌(AM)與不接菌(NM)。3種接蟲處理：接蚜蟲(H+)、不接蚜蟲(H-)和針刺模擬昆蟲取食(M)。設(shè)置針刺模擬昆蟲取食的處理，旨在避免因蚜蟲過早死亡造成蚜蟲取食頻率較低，未對植株造成明顯傷害，從而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不明顯?？偣?×3=6種處理，每處理5盆，共30盆，各處理隨機(jī)擺放。

AM真菌接種方法：需要接菌的處理，接種量為每盆100 g，接種菌劑為含有孢子、菌絲的土壤及其寄主植物的根段混合物。接種采用層播的方式，先稱取1 000 g土壤基質(zhì)加入花盆，再準(zhǔn)確稱取100 g菌劑，將其均勻平鋪于花盆中的土壤上，然后再稱400 g土壤基質(zhì)，將其均勻地撒在菌劑上層。不接AM真菌的處理則用等量滅菌土壤基質(zhì)代替AM真菌菌劑。用于接種的AM菌劑為用三葉草擴(kuò)繁所得的孢子、菌根根段、根外菌絲及培養(yǎng)基質(zhì)，每克菌劑含有>100個(gè)孢子。

催芽及播種：挑選大小一致、籽粒飽滿、健康無病蟲害的箭筈豌豆種子，將其置于10%的H2O2中浸泡5 min進(jìn)行表面消毒，然后傾去H2O2，用無菌水對種子進(jìn)行清洗，重復(fù)3遍即可。用滅菌鑷子將種子均勻擺放于鋪設(shè)了滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃培養(yǎng)箱催芽培養(yǎng)。待芽長至1～2 mm即可播種，每盆6株，播種深度為1～2 cm。

蚜蟲接種方法：在箭筈豌豆植株生長6周時(shí)進(jìn)行接蟲處理，用毛筆小心粘取蚜蟲，將其移至箭筈豌豆葉片上，每盆接種10只。針刺模擬處理則在每盆植株隨機(jī)選取10個(gè)葉片，用用昆蟲針在植物葉片上進(jìn)行針刺，造成10個(gè)直徑約為0.25 mm的創(chuàng)傷。

試驗(yàn)管理：出苗后定期觀察并記錄植株生長指標(biāo)。生長期間，根據(jù)天氣狀況定期稱重澆水。接種蚜蟲5 d后收獲植株，測量箭筈豌豆的莖葉干重、根系干重，以及抗病相關(guān)酶活性、脫落酸、茉莉酸、水楊酸及胰蛋白酶抑制劑等生理生化指標(biāo)。試驗(yàn)期間，溫度為20～28℃，每周五溫室定期噴施噠螨靈、吡蟲啉、溴氰菊酯等藥劑。

1.3 測定指標(biāo)及方法

菌根侵染率采用染色鏡檢法進(jìn)行測定[21]。莖葉干重和根干重采用稱重法測定。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，過氧化物酶(peroxidase，POD)，過氧化氫酶(catalase，CAT)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)等防御酶活性參照李合生的方法進(jìn)行測定[22]。全N、全P含量參照馬源等的方法測定[23]。脫落酸含量采用高效液相色譜法測定[24]。茉莉酸含量采用高效液相色譜法測定[25]。水楊酸含量采用高效液相色譜法測定[26]。胰蛋白酶抑制劑活性參照樊艷平等的方法測定[27]。

根長：由著生于莖干基部的根冠頂端到主根尖末端的長度。

根系面積：使用杭州萬深檢測科技有限公司生產(chǎn)的LA-S植物根系掃描儀進(jìn)行掃描，并計(jì)算植株根系面積。

蚜蟲存活率：從接蟲開始，每隔12 h觀察蚜蟲的存活情況，共統(tǒng)計(jì)4 d，計(jì)算蚜蟲的存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理并計(jì)算，用JMP IN 4統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用GraphPad Prism 5.01軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 菌根侵染率

NM處理的箭筈豌豆根系中均未檢測到菌根侵染結(jié)構(gòu)，接種AM真菌的處理，在顯微鏡下觀察到叢枝、泡囊及菌絲等菌根侵染結(jié)構(gòu)，表明AM真菌接種成功。菌根侵染率分別為57.5%，57.7%和58.8%，三個(gè)處理間無顯著差異(圖1)。

圖1 不同處理下的菌根侵染率Fig.1 Colonization rate in different treatments注：NM表示不接種AM真菌處理，AM表示接種G. tortuosum；H-表示無接蟲處理，H+表示蚜蟲處理，M表示針刺模擬昆蟲取食；不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同Note:NM=Inoculation with sterilized AM fungi,AM=Inoculation with G. tortuosum;H-=Don’t inoculate aphid;H+= Inoculation with aphid;M=Simulated insect feeding by prodding. Different low case letter above the bars means there are significant different across treatments at the 0.05 level. The same as below

2.2 植物生長情況

AM真菌對箭筈豌豆的生長產(chǎn)生了顯著的促進(jìn)效應(yīng)(表1，圖2)。與不接種扭形球囊霉(G.tortuosum)的處理相比較，接種扭形球囊霉的處理顯著提高了箭筈豌豆的地上生物量、地下生物量、根長以及根系面積，促進(jìn)了植株的生長(P<0.05)。相比對照，接種G.tortuosum后植株的莖葉干重提高約53.98%，根干重提高約179.69%，根長提高約24.34%，根系面積提高約38.85%。該試驗(yàn)結(jié)果表明，扭形球囊霉顯著促進(jìn)了箭筈豌豆的生長。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接蟲處理及針刺模擬蚜蟲取食未對箭筈豌豆的生物量及根系長度、面積產(chǎn)生影響，可能由于接蟲處理于植株生長發(fā)育為健全植株后進(jìn)行，且昆蟲取食時(shí)間僅為3～4 d，所以未對植株的生長產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)。

表1 AM真菌(AM)，豌豆蚜(H)及兩者互作效應(yīng)方差分析Table 1 ANOVA results(P) of Vicia sativa inoculated with or without arbuscular mycorrhizal (AM) andAcyrthosiphon pisum (H) and their interactions (AM*H)

注：NS表示無顯著影響(P>0.05)

Note:NS indicate no significant difference at the 0.05 level

圖2 AM真菌、豌豆蚜對箭筈豌豆生長指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of AM fungus and Acyrthosiphon pisum on the growth of Vicia sativa

2.3 蚜蟲存活率

由圖3可知，在接蟲后12 h，接種扭形球囊霉的植株上的蚜蟲已大幅度死亡，存活率僅為48%，而同一時(shí)間未接種AM真菌的植株蚜蟲存活率為60%，明顯高于AM真菌處理的植株。在隨后的12 h內(nèi)，AM真菌處理的植株上的蚜蟲死亡速度持續(xù)增大，到接蟲后36 h，蚜蟲存活率僅為12%，同一時(shí)間未接種AM真菌的植株蚜蟲存活率為32%。到接蟲后第4 d，AM真菌處理的植株上的蚜蟲全部死亡，而未接種AM真菌的植株上的蚜蟲還有8%存活，且觀察到有下一世代的幼蟲出現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，AM真菌扭形球囊霉對箭筈豌豆上的豌豆蚜具有抑制作用，甚至可能對豌豆蚜具有毒害作用。

圖3 AM真菌對豌豆蚜存活率的影響Fig.3 Effect of AM fungus on the survival rateof Acyrthosiphon pisum

2.4 防御酶活性

AM真菌對箭筈豌豆酶活性的影響結(jié)果與植物生長指標(biāo)保持一致(圖4)。接種AM真菌對超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，過氧化物酶(peroxidase，POD)活性均產(chǎn)生正效應(yīng)，AM真菌處理后這兩種防御酶活性均顯著高于未接菌處理，SOD活性較對照增加48.64%，POD活性較對照增加72.04%(P<0.05)。AM真菌對過氧化氫酶(catalase，CAT)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性的影響并不顯著。蚜蟲取食同樣對四種防御酶活性產(chǎn)生顯著影響，尤其是對CAT和PPO活性的影響更為顯著，與對照相比，蚜蟲取食后箭筈豌豆的CAT和PPO活性增加幅度高達(dá)20～30倍(P<0.05)。

圖4 AM真菌、豌豆蚜對箭筈豌豆防御酶活性的影響Fig.4 Effect of AM fungus and Acyrthosiphon pisum on defense enzyme activity of Vicia sativa

2.5 植物養(yǎng)分含量

接種AM真菌后，箭筈豌豆的地上及地下N含量、地下P含量分別增加50.62%，113.07%和62.42%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05，圖5)。但接種AM真菌后，箭筈豌豆的地上P含量反而較NM處理降低。不論是否接種AM真菌，接蟲處理對地上及地下N含量、地下P含量均變現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。但是對地上P含量的影響與此趨勢不同，NM處理中，蚜蟲取食降低了植株的地上P含量；而在AM真菌處理中，蚜蟲取食及針刺則顯著提高了地上P含量(P<0.01)，比對照增加超過1.5倍。

2.6 信號物質(zhì)(脫落酸、茉莉酸、水楊酸、胰蛋白酶抑制劑)

NM處理組及AM真菌處理組中，蚜蟲取食均顯著增加了植株的脫落酸含量，分別較對照增加55.53%和50.09(P<0.05)。在針刺模擬昆蟲取食的處理組中，接種AM真菌顯著降低了脫落酸含量，較未接種AM真菌的處理降低19.53%(P<0.05)(圖6)。

與對照相比，接種AM真菌后植株的茉莉酸含量顯著增加52.74%(P<0.05)，水楊酸含量增加3.44%。蚜蟲取食后，箭筈豌豆的茉莉酸和水楊酸含量分別增加32.80%和18.02%(P<0.05)(圖6)。

接種AM真菌+蚜蟲取食處理下，箭筈豌豆植株的胰蛋白酶抑制劑活性最高，與對照相比增加175.02%(P<0.05)。接種AM真菌后，其活性較對照增加95.95%(P<0.05)(圖6)。

圖5 AM真菌、豌豆蚜對箭筈豌豆N、P含量的影響Fig.5 Effect of AM fungus and Acyrthosiphon pisum on N and P content of Vicia sativa

圖6 AM真菌、豌豆蚜對箭筈豌豆信號物質(zhì)的影響Fig.6 Effect of AM fungus and Acyrthosiphon pisum on the signal substance of Vicia sativa

3 討論與結(jié)論

本研究探究了AM真菌扭形球囊霉對箭筈豌豆響應(yīng)豌豆蚜的影響，結(jié)果表明G.tortuosum可以促進(jìn)箭筈豌豆生長和N，P的吸收，提高植物防御性酶活性，增加茉莉酸、水楊酸等信號物質(zhì)含量，增強(qiáng)胰蛋白酶抑制劑活性，降低蚜蟲存活率，從而減輕豌豆蚜對箭筈豌豆的取食。已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在昆蟲-AM真菌-植物互作體系中，AM真菌可以促進(jìn)植物生長及養(yǎng)分吸收，改善植物的營養(yǎng)狀況，提高了植物整體健康水平，從而間接影響昆蟲的生長和繁殖[28]。在對百脈根(Lotusjaponicus)[29]、梯牧草(Phleumpratense)[30]、水稻(Oryzasativa)[31]、香根菊(Baccharishalimifolia)[32]等進(jìn)行的研究表明，接種AM真菌后，植物生物量增加，昆蟲數(shù)量減少，昆蟲的生長受到抑制。研究表明，AM真菌與昆蟲互作效應(yīng)因植物、AM真菌、昆蟲而異，接種AM真菌對昆蟲取食的影響不僅僅表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)[33-34]，如Catherine和Bennett[35]研究了40種AM真菌與昆蟲的互作關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中有42.5%的AM真菌對昆蟲趨性及取食有促進(jìn)作用，有抑制作用的占30.0%，無影響的占25.0%，變異的占2.5%。也有大量研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌與昆蟲互作，可以有效抑制昆蟲取食，降低危害程度[36]。究其原因，除影響植物整體健康水平之外，AM真菌也可通過改變植物體內(nèi)的揮發(fā)性物質(zhì)、防御性化合物的組分及濃度，調(diào)控植物生理生化機(jī)制，從而使宿主植物對昆蟲產(chǎn)生驅(qū)避作用，減少害蟲取食，降低對植物造成的傷害[37-38]。

AM真菌可調(diào)節(jié)植物信號物質(zhì)，影響蚜蟲取食及存活。AM真菌可以促進(jìn)番茄(Lycopersiconesculentum)抗蟲防御信號物質(zhì)的合成，并且通過其菌絲網(wǎng)絡(luò)傳遞抗蟲信號，從而提高植株抗蟲性[39]；在本研究中，接種G.tortuosum后，箭筈豌豆植株的防御信號物質(zhì)如茉莉酸、水楊酸的含量均較未接菌處理顯著提高，脫落酸含量則顯著降低。茉莉酸、水楊酸介導(dǎo)的信號傳遞途徑均與植物抗性密切相關(guān)，二者都是植物對外界刺激(如昆蟲取食)做出應(yīng)答，進(jìn)而誘導(dǎo)抗性基因表達(dá)的信號分子，可以促進(jìn)宿主植物自身防御系統(tǒng)的快速建立，以響應(yīng)外界脅迫[40-42]。Sabine等[43]也發(fā)現(xiàn)昆蟲取食后，菌根化植株中蛋白酶抑制劑基因(PI-1和PI-II)顯著上調(diào)表達(dá)，這是植物體內(nèi)一種重要的抗蟲基因；且接種AM真菌后，植株的的茉莉酸感知突變體基因LOXD和茉莉酸合成突變體基因PI-II不表達(dá)，茉莉酸過表達(dá)植株中的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。因此，在昆蟲-AM真菌-植物三者互作時(shí)，AM真菌可以調(diào)控植物相關(guān)防御基因表達(dá)，改變體內(nèi)防御性化學(xué)物質(zhì)的變化，從而影響昆蟲的采食和生長。

本研究亦發(fā)現(xiàn)，接種G.tortuosum后，脫落酸含量降低，說明AM真菌的定殖減緩了昆蟲取食對植物葉片造成的危害。接種AM真菌后，箭筈豌豆植株葉片中的胰蛋白酶抑制劑活性顯著提高。胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor,TI)能夠與生物體內(nèi)的酶結(jié)合，降低酶作用底物分解速率，從而抑制胰蛋白酶水解活性，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的生理生化代謝[44-46]。有研究表明，胰蛋白酶抑制劑可以作用于昆蟲腸道，與胰蛋白酶結(jié)合，抑制其活性，昆蟲對食物的消化受到嚴(yán)重影響，無法充分吸收和利用食物中的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致昆蟲營養(yǎng)不良甚至死亡[47-48]。

本研究雖然發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌的定殖對豌豆蚜的發(fā)生具有一定程度的抑制作用，但試驗(yàn)僅在溫室進(jìn)行，且溫室每周五定期噴施噠螨靈、吡蟲啉、溴氰菊酯等藥劑，雖然對試驗(yàn)植物進(jìn)行了遮蔽，但很大程度上影響了蚜蟲存活率。在實(shí)際生產(chǎn)中，田間氣候條件復(fù)雜多變，AM真菌-植物-昆蟲互作模式會(huì)因物種、作用時(shí)間、自然環(huán)境的復(fù)雜性等不同存在較大的差異；另外，一旦蟲害爆發(fā)，采用生防菌劑遠(yuǎn)不如化學(xué)防治見效快，且研制生防菌劑需耗費(fèi)大量人力、物力及資金，即使研發(fā)成功，如何進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)仍具有較高的應(yīng)用技術(shù)難度。因此，在進(jìn)行AM真菌-植物-昆蟲互作的相關(guān)研究時(shí)應(yīng)考慮環(huán)境等因素的影響，研究不同響應(yīng)方式之間的聯(lián)系，明確AM真菌與昆蟲相互作用的方式和機(jī)制，分析AM真菌-植物-昆蟲互作的復(fù)雜關(guān)系，趨利避害，利用自然界生物之間的關(guān)系，控制農(nóng)業(yè)害蟲的發(fā)生，是實(shí)現(xiàn)綠色、健康可持續(xù)許發(fā)展的重要途徑。