王程 紀(jì)朋艷 李慶華 李強(qiáng) 安英 隋春紅

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

1 材料和方法

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理 采用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)人肝L02細(xì)胞，每2 d按1∶4的比例傳代1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)PBS清洗2次，再用2.5 g/L胰酶細(xì)胞消化液使細(xì)胞懸浮，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml，再根據(jù)不同的細(xì)胞密度接種于不同孔徑培養(yǎng)板中。處理前用不含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h使細(xì)胞同步化，然后隨機(jī)分為如下5組：(1)對(duì)照組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；(2)SOD抑制組：培養(yǎng)液中加入DETC；(3)CAT抑制組：培養(yǎng)液中加入ATZ；(4)GPx抑制組：培養(yǎng)液中加入PEN；(5)CAT和GPx聯(lián)合抑制組：培養(yǎng)液中加入ATZ和PEN。給藥劑量分別為2 mmol/L DETC〔7〕，10 mmol/L ATZ〔8〕，0.1 mmol/L PEN〔9〕，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12 h后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4細(xì)胞相對(duì)活性的測(cè)定 將L02細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96孔板上培養(yǎng)，經(jīng)處理后棄去各組剩余培養(yǎng)液，在每孔加入含5 g/L MTT培養(yǎng)液120 μl，37℃，5% CO2環(huán)境中孵育4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加200 μl DMSO，輕度震搖10 min溶解結(jié)晶物，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活性。

1.5細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)的測(cè)定 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3、Beclin-1、P62蛋白表達(dá)。將L02細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種于6孔板上培養(yǎng)，經(jīng)處理后收集細(xì)胞，PBS清洗2次，提取細(xì)胞總蛋白后考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。取細(xì)胞總蛋白液200 μl，加5×蛋白上樣緩沖液50 μl，煮沸10 min。配制15%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔加50 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)印到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的LC3B、Beclin-1、SQSTM1/p62和β-actin一抗，4℃孵育14 h，TBST漂洗后加1∶2 000稀釋的HRP-IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST充分漂洗后加電化學(xué)發(fā)光試劑顯影，用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

表1 抗氧化酶抑制劑對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能力和H2O2、GSH含量的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；下表同

2.2抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響 與對(duì)照組比較，SOD抑制組細(xì)胞內(nèi)SOD活力顯著降低(P<0.05)，CAT抑制組、CAT和GPx聯(lián)合抑制組細(xì)胞內(nèi)CAT活力顯著降低(P<0.05)，GPx抑制組及CAT和GPx聯(lián)合抑制組細(xì)胞內(nèi)GPx活力顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3抑制劑對(duì)細(xì)胞相對(duì)活性的影響 與對(duì)照組比較，各組細(xì)胞相對(duì)活性顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 抗氧化酶抑制劑對(duì)L02細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT和GPx活力及細(xì)胞相對(duì)活性的影響

2.4抑制劑對(duì)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3、Beclin-1和P62表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，SOD抑制組及CAT和GPx聯(lián)合抑制組細(xì)胞中Beclin-1和P62的相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均顯著提高(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 抗氧化酶抑制劑對(duì)L02細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3、Beclin-1和P62表達(dá)的影響

1～5:對(duì)照組、SOD抑制組、CAT抑制組、GPx抑制組、CAT和GPx聯(lián)合抑制組圖1 抗氧化酶抑制劑對(duì)L02細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3、Beclin-1和P62表達(dá)的影響

表4 各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的相關(guān)性(r值)

1)P<0.05

3 討 論