倪宇昕 章立群 謝安琪 劉學(xué) 楊旭

(1華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518000；2吉林大學(xué)口腔醫(yī)院)

牙列缺損是老年人常見(jiàn)的口腔疾病，而種植治療是最佳的治療方案之一?？谇环N植體周圍炎是種植治療最常見(jiàn)的并發(fā)癥，病因是菌斑生物膜及其引起的免疫炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成之一，能對(duì)外界刺激產(chǎn)生炎癥反應(yīng)〔1,2〕。有多個(gè)研究證明聯(lián)合應(yīng)用脂多糖(LPS)和干擾素(IFN)-γ刺激巨噬細(xì)胞后，會(huì)誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞極化，表現(xiàn)為白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-6的升高，引起后續(xù)的炎癥反應(yīng)〔3～5〕。有學(xué)者報(bào)道了巨噬細(xì)胞的M1極化參與種植體周圍炎的發(fā)生和進(jìn)展〔6,7〕。

纈氨酸是人體必需的氨基酸之一，根據(jù)其構(gòu)象可以分為L(zhǎng)-纈氨酸和D-纈氨酸，在人體中存在的均為L(zhǎng)-纈氨酸。前期研究顯示L-纈氨酸參與眾多的生理反應(yīng)，影響炎癥和腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸〔8,9〕。然而L-纈氨酸對(duì)巨噬細(xì)胞M1極化的作用還不清楚，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法分析L-纈氨酸對(duì)巨噬細(xì)胞的作用。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器 L-纈氨酸溶液0.384 mg L-纈氨酸(Sigma，美國(guó))溶于10 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，制備成320 mmol/L的儲(chǔ)備液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆?。LPS溶液：將購(gòu)買的LPS(Sigma，美國(guó))粉末用PBS稀釋成500 μg/ml備用。IFN-γ溶液：將購(gòu)買的重組小鼠IFN-γ(碧云天，中國(guó))用PBS稀釋成80 ng/μl備用?？俁NA提取試劑盒購(gòu)自上海生工公司(中國(guó))，IL-1β、TNF-α和IL-6的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自碧云天公司(中國(guó))。使用的主要儀器有Invitrogen Qubit2.0光度計(jì)；Thermo臺(tái)式高速低溫離心機(jī)；北京六一DYY-11電泳儀；復(fù)日科技FR-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)。

1.2巨噬細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，用RPMI1640完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%雙抗)，置于條件為37℃和5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)分為空白組、誘導(dǎo)組和L-纈氨酸組?？瞻捉M細(xì)胞使用RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；LPS+IFN-γ組細(xì)胞應(yīng)用條件培養(yǎng)液(RPMI1640完全培養(yǎng)液、50 μg/ml LPS、20 ng/ml IFN-γ)進(jìn)行培養(yǎng)；L-纈氨酸組中細(xì)胞在條件培養(yǎng)液基礎(chǔ)上分別增加0.8 mmol/L、0.4 mmol/L、0.2 mmol/L和0.1 mmol/L的L-纈氨酸。每組進(jìn)行獨(dú)立的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4ELISA檢測(cè) 將上述各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別收集培養(yǎng)基上清，經(jīng)過(guò)10 000 r/min離心5 min后，將上清轉(zhuǎn)移并進(jìn)行ELISA檢測(cè)。按IL-1β、TNF-α和IL-6試劑盒中說(shuō)明，建立標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，加入待測(cè)上清后進(jìn)行洗板和顯色等步驟，最后利用酶標(biāo)儀讀數(shù)，每組進(jìn)行3次重復(fù)。

1.5轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 向上述LPS+IFN-γ組和0.8 mmol/L的L-纈氨酸組細(xì)胞中，分別加入1 ml的Trizol溶液，按設(shè)計(jì)盒說(shuō)明提取總RNA并應(yīng)用Qubit2.0檢測(cè)RNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA完整性及基因組污染情況。將質(zhì)檢合格的RNA交付上海生工公司進(jìn)行建庫(kù)與測(cè)序，所用測(cè)序平臺(tái)為IlluminaHiseqTM 2000。獲得下機(jī)數(shù)據(jù)后應(yīng)用Fast QC軟件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和過(guò)濾，用Hisat2軟件將質(zhì)控后的reads同參考基因組進(jìn)行對(duì)比。計(jì)算每個(gè)基因的(TPM)，并據(jù)此采用DESeq進(jìn)行分析，將篩選條件設(shè)為：q值<0.05 且差異倍數(shù)log 2 FoldChange>1。最后根據(jù)篩選出的顯著差異基因結(jié)果，將其注釋到GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)，并分析可能涉及的細(xì)胞活動(dòng)。

2 結(jié) 果

2.1ELISA結(jié)果 當(dāng)用LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激巨噬細(xì)胞時(shí)，檢測(cè)的三種炎癥因子均明顯升高。當(dāng)L-纈氨酸存在時(shí)，TNF-α表達(dá)量無(wú)明顯規(guī)律性的變化；但是IL-1β與IL-6的表達(dá)出現(xiàn)明顯劑量相關(guān)，即L-纈氨酸會(huì)促進(jìn)這兩種炎癥因子的分泌。見(jiàn)表1。

表1 ELISA檢測(cè)結(jié)果

與空白組相比：1)P<0.05

2.2RNA瓊脂糖凝膠電泳 成功的提取了擬進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的六個(gè)樣品RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明RNA條帶清晰，拖尾較少，完整度好，達(dá)到建庫(kù)要求。見(jiàn)圖1。

2.3差異基因表達(dá) 經(jīng)過(guò)測(cè)序和質(zhì)控，分別計(jì)算了不同樣本的TPM值，并經(jīng)過(guò)生物學(xué)重復(fù)，得到了L-纈氨酸組與空白組的顯著差異基因28個(gè)，其中升高6個(gè)，降低22個(gè)，這些基因的TPM值及變化倍數(shù)如表2所示。

2.4GO和KEGG富集分析 將上述28個(gè)顯著差異表達(dá)的基因分別進(jìn)行注釋，GO功能基因分類分析的結(jié)果如圖2所示，三個(gè)大類中的多個(gè)亞類均有基因富集；KEGG分析結(jié)果如圖3所示，三條通路的基因富集數(shù)尤為明顯。

1：Marker，2～4：LPS+IFN-γ，5～7：0.8 mmol/L L-纈氨酸圖1 瓊脂糖凝膠電泳

表2 L-纈氨酸組中顯著差異表達(dá)的基因信息

圖2 顯著表達(dá)差異基因的GO分析

圖3 基于差異分析基因的KEGG分析

3 討 論

種植體周圍炎是口腔種植治療最常見(jiàn)的并發(fā)癥，表現(xiàn)為牙齦紅腫、種植體松動(dòng)甚至脫落，增加患者負(fù)擔(dān)〔10〕。牙菌斑是種植體周圍炎的始動(dòng)因素，宿主的免疫反應(yīng)也參與其中，影響種植體周圍炎的進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸〔11，12〕。巨噬細(xì)胞是對(duì)牙菌斑刺激發(fā)生反應(yīng)的最主要天然免疫細(xì)胞之一，其在感受到LPS存在后，會(huì)通過(guò)Toll樣受體(TLR)引起下游NF-κB等信號(hào)通路的激活，最終引起諸多炎癥因子的升高，包括TNF-α、IL-1β和IL-6等。這些炎癥因子會(huì)通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)更為廣泛和強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮清除細(xì)菌的作用〔13～15〕。但是過(guò)于強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)也會(huì)引起組織的破壞，促進(jìn)種植體周圍炎的發(fā)生。

通過(guò)ELISA結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，LPS與IFN-γ聯(lián)合應(yīng)用能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌炎性因子，這與前人研究〔16〕結(jié)果相符，隨著培養(yǎng)體系中L-纈氨酸濃度的增加，巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β和IL-6顯著增加，但是對(duì)TNF-α的表達(dá)無(wú)明顯影響，說(shuō)明L-纈氨酸能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化，從而發(fā)揮抗菌作用。IL-6發(fā)揮作用有兩種途徑，第一是cis途徑，IL-6與細(xì)胞膜上的IL-6受體(IL6R)結(jié)合，引發(fā)gp130蛋白聚集形成三聚體；另一種trans途徑，適用于細(xì)胞膜上沒(méi)有受體的細(xì)胞，IL-6與可溶性的IL-6R(sIL6R)結(jié)合，引起下游gp130蛋白聚集。IL-6并不直接調(diào)控破骨細(xì)胞功能，而是通過(guò)trans途徑影響RANKL表達(dá)，間接促進(jìn)破骨細(xì)胞功能〔17，18〕。但是值得注意的是，高濃度的L-纈氨酸可能會(huì)過(guò)度誘發(fā)宿主的炎癥反應(yīng)，在實(shí)際應(yīng)用中需要注意控制使用濃度，相關(guān)的最適濃度仍需進(jìn)一步研究。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠以高通量方式分析特定模式下的細(xì)胞mRNA表達(dá)情況，因此成為研究細(xì)胞作用和分析機(jī)制的高效方法〔19〕。GO注釋分析，說(shuō)明L-纈氨酸對(duì)于巨噬細(xì)胞的作用不止局限于炎性因子表達(dá)。隨后的KEGG分析結(jié)果表明多個(gè)信號(hào)通路可能介導(dǎo)了L-纈氨酸的調(diào)控作用，例如PI3K-Akt通路、Rap1通路和Jak-STAT通路等。在其他研究〔20，21〕中，這些通路已被報(bào)道參與了巨噬細(xì)胞的激活過(guò)程。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)潛在的作用途徑，為進(jìn)一步后續(xù)探討L-纈氨酸調(diào)控巨噬細(xì)胞活化的機(jī)制提供了方向。本研究初步發(fā)現(xiàn)了L-纈氨酸能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)了可能的作用通路，但是考慮到L-纈氨酸在人體代謝中的基礎(chǔ)地位，關(guān)于L-纈氨酸對(duì)巨噬細(xì)胞代謝中的作用和具體機(jī)制，仍然需要進(jìn)一步研究。