徐子琴 王帥 陳冬

(1輝縣市人民醫(yī)院耳鼻喉科，河南 輝縣 453600；2錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科)

變應(yīng)性鼻炎(AR)是指?jìng)€(gè)體暴露于過敏原后通過免疫球蛋白(Ig)E介導(dǎo)的介質(zhì)釋放、并有多種細(xì)胞因子等參與的引起鼻腔黏膜炎癥的疾病，調(diào)查顯示AR疾病影響了全球10%～40%的人口，老年性AR的患病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前以藥物治療控制臨床癥狀為主〔1～3〕，然而其發(fā)病機(jī)制不詳。隨著人們對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的研究，逐漸發(fā)現(xiàn)它是致敏階段的關(guān)鍵細(xì)胞〔4〕。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在AR小鼠模型及患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)目明顯減少〔5,6〕，然而針對(duì)Treg細(xì)胞免疫失衡的調(diào)控因素尚無定論。T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域(Tim)-3是Ig和Tim家族細(xì)胞表面分子，廣泛參與腫瘤、哮喘及自身免疫性疾病等的免疫調(diào)節(jié)〔7〕，本研究主要探討Tim-3是否通過調(diào)控Treg細(xì)胞的免疫失衡，進(jìn)而參與AR的發(fā)病。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本收集 選取2017年7月至2018年10月就診于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的患者和招募的志愿者作為研究對(duì)象。研究對(duì)象均為年滿60周歲的老年人，均進(jìn)行血清特異性IgE(sIgE)檢測(cè)。第一部分實(shí)驗(yàn)：以招募的志愿者11例(男/女為4/7)為健康對(duì)照組，平均年齡(63.7±2.8)歲，以急性發(fā)作期入院的AR患者25例(男/女為9/16)為實(shí)驗(yàn)組，平均年齡(64.1±3.7)歲。第二部分實(shí)驗(yàn)：以急性發(fā)作期入院的AR患者30例，加入Tim-3的配體半乳糖凝集素(Galectin)-9激活前后進(jìn)行對(duì)照比較。納入患者符合AR診斷和治療指南〔8〕的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。研究對(duì)象至少在1個(gè)月內(nèi)沒有發(fā)生過呼吸道感染疾病，都未曾服過全身糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、免疫抑制劑，除外結(jié)核、肝炎等傳染性疾病和其他全身性疾病。本臨床研究獲得錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且和每位招募的志愿者簽訂了知情同意書。各組受試者的性別、年齡等一般資料具有可比性。

1.2第一部分實(shí)驗(yàn) 兩組均采集2 ml外周靜脈血，提取外周血中的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)加入FC受體(FcR)阻斷劑，均勻混合，避光孵育15 min后，加入APC/Cy7耦合的抗人CD4抗體、BV510耦合的抗人CD25抗體和PE耦合的抗人Tim-3抗體，避光孵育15 min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,1 200 r/min離心棄上清，加入固定液,常溫避光45 min，然后加入破膜洗液，離心棄上清，再加入胞內(nèi)Alexa647耦合的抗人叉頭框(Fox)P3抗體，室溫避光孵育1 h，最后加入對(duì)應(yīng)破膜洗液，離心棄上清，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg百分比及其細(xì)胞表面的Tim-3表達(dá)，用Flowjo10分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3第二部分實(shí)驗(yàn) 提取外周血中的PBMC加入淋巴細(xì)胞激活劑〔丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)，離子霉素，高爾基體阻斷劑〕、半乳凝集素(Galectin)-9，37℃孵育4 h后加入1 ml的PBS，離心棄上清，加入FcR阻斷劑，室溫避光孵育15 min后，加入Percp/Cy5.5耦合的抗人CD3抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)耦合的抗人CD8抗體、BV510耦合的抗人CD25抗體，避光孵育15 min后用PBS清洗,1 200 r/min離心棄上清，加入固定液400 μl,常溫避光45 min，然后加入破膜洗液，離心棄上清，再加入胞內(nèi)Alexa647耦合的抗人FoxP3抗體和PE/Cy7耦合的抗人白細(xì)胞介素(IL)-10抗體,室溫避光孵育1 h，最后加入對(duì)應(yīng)破膜洗液，離心棄上清，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞分泌IL-10，用Flowjo10分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Fisher確切概率法、Maan-WhitneyU檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血中Treg細(xì)胞及Tim-3+Treg細(xì)胞的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組Treg細(xì)胞百分比較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，而實(shí)驗(yàn)組Treg細(xì)胞表面的Tim-3表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著增高(P<0.01)。見表1、圖1。

表1 兩組外周血中Treg及Tim-3+Treg比較

1:外周血淋巴細(xì)胞群；2：CD4+細(xì)胞群；3：實(shí)驗(yàn)組Treg細(xì)胞；4：健康對(duì)照組Treg細(xì)胞；5：實(shí)驗(yàn)組Tim-3+Treg細(xì)胞百分比；6：健康對(duì)照組Tim-3+Treg細(xì)胞百分比圖1 兩組外周血中Treg所占比例及Tim-3+Treg細(xì)胞的比例

2.2相關(guān)性分析 AR患者中Treg的表達(dá)與其表面Tim-3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.785，P<0.05)。

2.3激活劑阻斷前后外周血中Treg細(xì)胞比例及分泌IL-10+Treg的表達(dá) 阻斷后外周血Treg細(xì)胞百分比較阻斷前顯著上調(diào)(P<0.01)。阻斷IL-10+Treg較阻斷前顯著升高(P<0.001)。見表2、圖2。

表2 Tim-3激活阻斷劑前后兩組外周血中Treg及IL-10+Treg的百分比

1:外周血淋巴細(xì)胞群；2：CD4+細(xì)胞群；3：阻斷前Treg細(xì)胞百分比；4:阻斷后Treg細(xì)胞的百分比；5：阻斷前IL-10+Treg細(xì)胞百分比；6：阻斷后IL-10+Treg細(xì)胞的百分比圖2 激活劑阻斷前后Treg百分比及IL-10+Treg的百分比

3 討 論

AR是一種常見的過敏性疾病，主要是由IgE介導(dǎo)的，以釋放炎癥介質(zhì)，并有多種細(xì)胞因子如肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等參與的鼻腔黏膜炎癥的反應(yīng)性疾病，主要臨床癥狀是陣發(fā)性打噴嚏、流涕、鼻癢和鼻塞，嚴(yán)重者可伴發(fā)鼻息肉、鼻竇炎、哮喘及過敏性結(jié)膜炎等〔9〕。以前普遍以為AR主要由Th1/Th2細(xì)胞的免疫失衡反應(yīng)所造成的，但隨著人們對(duì)AR疾病的不斷研究，該免疫失衡不足以解釋AR的炎癥反應(yīng)。研究顯示Treg數(shù)目的改變或功能的缺失在過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用〔10，11〕。

Tim-3是Tim家族中的一員。既往研究指出，Tim-3主要通過調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞的平衡從而參與Th2細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，比如過敏性哮喘〔12〕。Banerjee等〔13,14〕發(fā)現(xiàn)Tim-3可以通過調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞從而參與哮喘、炎癥性疾病、自身免疫性疾病等的免疫調(diào)節(jié),并在免疫自穩(wěn)與凋亡細(xì)胞的清除過程中發(fā)揮重要作用，而Tim-3+FoxP3+Treg細(xì)胞的抑制功能要強(qiáng)于Tim-3-FoxP3+Treg細(xì)胞〔15〕。Galectin-9作為Tim-3的配體之一，與Tim-3結(jié)合后可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的程序性死亡，被認(rèn)為是Tim-3的激活劑〔16〕。有研究〔17〕表明Galectin-9可以通過抑制Th17細(xì)胞增強(qiáng)Foxp3+Treg從而改善自身免疫反應(yīng),但其作用依賴于與Tim-3的結(jié)合。本試驗(yàn)顯示，體外給予激活劑Galectin-9后，患者血液中Treg細(xì)胞百分比及IL-10+Treg的百分比上調(diào)，提示了Galectin-9可以通過激活Tim-3通路抑制AR的炎癥反應(yīng)。

綜上，Tim-3可能打破了Treg細(xì)胞在外周血中的平衡從而參與AR的發(fā)病過程；激活Galectin-9/Tim-3通路可以促使AR炎癥轉(zhuǎn)歸。這可能為AR的治療帶來新的思路。