劉軍

（常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院體育學(xué)院，江蘇 常州 213164）

肥胖、血脂異常及久坐生活方式是導(dǎo)致心血管疾病、糖尿病等多種疾病的高危因素，是亞健康人群的重要特征［1］。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可通過增加去脂體質(zhì)量、減少體脂量、改善體脂分布促進(jìn)人體恢復(fù)健康，其效果與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的類型（有氧/阻力運(yùn)動(dòng)）以及運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度有關(guān)［2］。既往研究［2］表明有氧運(yùn)動(dòng)可減輕體質(zhì)量和體脂含量，調(diào)節(jié)骨骼肌內(nèi)的重要代謝通路（線粒體代謝等），運(yùn)動(dòng)量是影響血脂水平、胰島素敏感性的重要因素。

基于高通量數(shù)據(jù)所進(jìn)行的基因組學(xué)研究，已成為揭示疾病機(jī)制和基因生物功能的重要手段，基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）是解釋基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的核心分析工具之一［3］。GSEA可對(duì)樣本所表達(dá)的基因進(jìn)行分類，把具有相同生物學(xué)功能和調(diào)節(jié)機(jī)制、處于同一信號(hào)通路的基因富集出來，通過富集的這些優(yōu)勢(shì)通路闡明其生物學(xué)特征及相關(guān)機(jī)制，進(jìn)而提示疾病防控靶點(diǎn)或指導(dǎo)疾病進(jìn)展監(jiān)控與預(yù)后預(yù)測(cè)。已有研究［4］顯示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增加胰島素敏感性，通過對(duì)骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)影響心血管代謝疾病的發(fā)生與發(fā)展，而心血管代謝的改善與有氧運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度有關(guān)。

本研究利用基因數(shù)據(jù)集GSE48278，以具有慢性心血管代謝疾病危險(xiǎn)因素的亞健康狀態(tài)人群為研究對(duì)照，探討不運(yùn)動(dòng)以及不同強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)6個(gè)月對(duì)男性和女性骨骼肌mRNA表達(dá)譜的改變，并利用生物信息學(xué)方法分析此種改變潛在的生物功能與分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)集與分級(jí)訓(xùn)練方案

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載代謝綜合征患者骨骼肌基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE48278。共納入112例，隨機(jī)選取1998年至2003和2004年至2009年進(jìn)行的第1次和第2次通過特定方式體育鍛煉進(jìn)行有針對(duì)性的降低風(fēng)險(xiǎn)干預(yù)措施的研究（studies of a targeted risk reduction intervention through sefined exercise，STRRIDE）試驗(yàn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～70歲；（2）不活動(dòng)；（3）超重至輕度肥胖（體質(zhì)量指數(shù)25～35 kg/m2）和血脂異常［低密度脂蛋白膽固醇：3.34～4.92 mmol/L或高密度脂蛋白膽固醇＜ 1.04 mmol/L（男性）或1.17 mmol/L（女性）］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）已確診糖尿病或空腹血糖＞ 6.99 mmol/L；（2）高血壓（血壓＞ 160/90 mmHg）；（3）已知患有心血管疾病，禁止運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的肌肉骨骼疾??；（4）吸煙；（5）服用影響糖/脂類代謝的藥物；（6）應(yīng)用減肥食譜。參與者隨機(jī)分配到不運(yùn)動(dòng)或小量中、高有氧運(yùn)動(dòng)組，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度分別為小量中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（5 021 kJ/周，40%～55%峰值）、小量高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（5 021 kJ/周，65%～80%峰值）、大量高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（8 368 kJ/周，65%～80%峰值）、聯(lián)合阻力訓(xùn)練、單獨(dú)阻力訓(xùn)練。在當(dāng)?shù)亟∩碇行倪M(jìn)行觀察。入組時(shí)使用最大運(yùn)動(dòng)量測(cè)試確定參與者的峰值、最大心率和對(duì)應(yīng)于規(guī)定強(qiáng)度的心率范圍。參與者按指定的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練處方進(jìn)行6個(gè)月運(yùn)動(dòng)。通過心率監(jiān)測(cè)器的記錄和肉眼監(jiān)督來驗(yàn)證運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的依從性。具體方法見文獻(xiàn)［4］。

1.2 研究分組

基于研究目的，本研究選取不運(yùn)動(dòng)和有氧運(yùn)動(dòng)的參與者。剔除阻力訓(xùn)練者。另外，大量高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)量超過中國(guó)人常規(guī)耐受范圍，參考價(jià)值有限，因此也被剔除。最終納入者按性別劃分，每個(gè)性別納入者分為3組：不運(yùn)動(dòng)組（5例）、小量中強(qiáng)度組（5例）、小量高強(qiáng)度組（5例），共30例。

1.3 基因數(shù)據(jù)分析

每例在入組時(shí)和系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)6個(gè)月后，從骨骼肌活組織檢查提取總RNA進(jìn)行基因表達(dá)微陣列分析（Affymetrix U133 Plus 2.0）。本研究應(yīng)用該數(shù)據(jù)集的series matrix數(shù)據(jù)。以探針為基本單位進(jìn)行后續(xù)分析。

應(yīng)用Gene Set Enrichment analysis 3.0版軟件，以入組時(shí)與不運(yùn)動(dòng)、小量中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)、小量高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)6月后比較，以MSigDB在線基因集數(shù)據(jù)庫(kù)的hallmark gene sets作為參考基因集，對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行GSEA。設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次。以P＜ 0.05，且FDRq＜ 0.25為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因集進(jìn)行l(wèi)eading edge gene分析。使用GPL570的注釋文件對(duì)leading edge gene分析所選定的探針進(jìn)行注釋，利用genecards網(wǎng)站（http://www.genecards.org）匯總各個(gè)相關(guān)基因的功能等信息。

2 結(jié)果

2.1 男性患者鍛煉前后的GSEA比較

結(jié)果顯示，與入組時(shí)比較，6個(gè)月后不運(yùn)動(dòng)組的標(biāo)本富集了“凋亡”，“炎癥反應(yīng)”，“上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化”，“KRAS信號(hào)”等通路，如IL6_JAK_STAT3_SIGNALING、ALLOGRAFT_REJECTION、EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION、COMPLEMENT、APOPTOSIS、INFLAMMATORY_RESPONSE、KRAS_SIGNALING_UP、APICAL_SURFACE、XENOBIOTIC_METABOLISM、COAGULATION和IL2_STAT5_SIGNALING等；小量中強(qiáng)度組未富集任何通路；而小量高強(qiáng)度組富集的通路為PANCREAS_BETA_CELLS。見表1、圖1。

2.2 女性鍛煉前后的GSEA比較

與入組時(shí)比較，6個(gè)月后不運(yùn)動(dòng)組的標(biāo)本未富集任何通路；小量中強(qiáng)度組富集了氧化磷酸化（OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION）、過氧化物酶體（PEROXISOME）等通路；小量高強(qiáng)度組則富集了氧化磷酸化（OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION）、脂肪發(fā)生（ADIPOGENESIS）、脂肪酸代謝（FATTY_ACID_METABOLISM）、HEDGEHOG信號(hào)等通路，見表1、圖2。

表1 亞健康狀態(tài)高危人群小量有氧運(yùn)動(dòng)或不運(yùn)動(dòng)6個(gè)月骨骼肌中基因表達(dá)譜的基因集富集分析Tab.1 Gene set enrichment analysis for the gene expression profile in the skeletal muscles of cardiometabolic high-risk population with/without 6 months of low-amount aerobic exercise

圖1 與入組時(shí)比較，男性不運(yùn)動(dòng)組6個(gè)月后骨骼肌基因譜的GSEA結(jié)果Fig.1 GSEA results of skeletal muscle gene profiles in males without exercise after 6 months compared with the gene profiles at enrollment

2.3 男性、女性鍛煉前后領(lǐng)頭亞群基因分析

圖2 與入組時(shí)比較，女性小量高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組6個(gè)月后骨骼肌基因譜的GSEA結(jié)果Fig.2 GSEA results of the skeletal muscle gene profiles in females with 6 months low-amount vigorous-intensity exercise compared with the gene profiles at enrollment

與入組時(shí)比較，男性不運(yùn)動(dòng)組6個(gè)月后的骨骼肌細(xì)胞中在所富集通路出現(xiàn)頻次最多的領(lǐng)頭亞群基 因 包 括TIMP2、IL2RB、LYN、SERPINE1等，見 圖3A。與入組時(shí)比較，女性小量高強(qiáng)度組6個(gè)月后骨骼肌細(xì)胞中高頻度出現(xiàn)于富集通路中的領(lǐng)頭亞群基因 包 括ECHS1、DLD、SDHC、ECH1、ACAA2、MDH2、ACADM、DECR1、RETSAT等，見圖3B。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，男性與入組時(shí)比較，不運(yùn)動(dòng)組骨骼肌細(xì)胞富集了凋亡、炎癥反應(yīng)和異常增生與轉(zhuǎn)化相關(guān)通路，在各強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組未發(fā)現(xiàn)此種改變；女性不運(yùn)動(dòng)組骨骼肌細(xì)胞無特殊變化，小量中高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練則增強(qiáng)骨骼肌有氧代謝、維持肌纖維結(jié)構(gòu)以及促進(jìn)肌細(xì)胞損傷修復(fù)等生物過程。

骨骼肌作為代謝、心血管相關(guān)疾病的重要靶器官，其結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)態(tài)是維持人體健康的重要基石［4］。而人體由亞健康狀態(tài)發(fā)展為代謝、心血管疾病的過程中，骨骼肌的代謝適應(yīng)性下降，出現(xiàn)胰島素敏感性下降/抵抗，從而導(dǎo)致多重代謝改變，其本質(zhì)主要存在以下兩方面變化：（1）線粒體氧化能力/三羥酸循環(huán)破壞；（2）免疫功能破壞、炎癥/免疫反應(yīng)增強(qiáng)、細(xì)胞死亡/凋亡增多。已有研究［5-6］顯示代謝異常的小鼠模型或具有代謝綜合征/2型糖尿病的患者中，可觀察到骨骼肌發(fā)生胰島素抵抗以及損傷相關(guān)性改變（線粒體功能失調(diào)、線粒體超氧產(chǎn)物以及凋亡、免疫相關(guān)信號(hào)通路激活）。

本研究結(jié)果顯示，亞健康狀態(tài)的男性，6個(gè)月不運(yùn)動(dòng)骨骼肌細(xì)胞出現(xiàn)了炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫活性、排斥反應(yīng)、補(bǔ)體系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，并存在凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、高凝和異常增生信號(hào)通路活化，即向更易于發(fā)生心血管、代謝疾病的方向發(fā)展。而運(yùn)動(dòng)情況下未出現(xiàn)這些不利的因素，在小量高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組出現(xiàn)了胰島β-細(xì)胞增強(qiáng)，即可能通過促進(jìn)胰島素分泌逆轉(zhuǎn)亞健康狀態(tài)。亞健康狀態(tài)女性6個(gè)月不運(yùn)動(dòng)未見骨骼肌發(fā)生不利變化，而小量運(yùn)動(dòng)6個(gè)月無論中強(qiáng)度還是高強(qiáng)度均可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞中的氧化磷酸化代謝、增強(qiáng)過氧化物及脂肪酸的代謝，從而促進(jìn)亞健康狀態(tài)逆轉(zhuǎn)。另外，已有研究［7］顯示小量高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中活化的HEDGEHOG信號(hào)通路可能有利于促進(jìn)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后骨骼肌發(fā)育、損傷修復(fù)，并負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)快慢肌纖維特性。

圖3 與入組時(shí)比較，參與者6個(gè)月后骨骼肌中領(lǐng)頭亞群基因分析結(jié)果Fig.3 Leading edge genes of the skeletal muscles in participants after 6 months compared with those at enrollment

根據(jù)領(lǐng)頭亞群基因分析結(jié)果，男性不運(yùn)動(dòng)組中上調(diào)的TIMP2基因參與了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種機(jī)體變化，并與高血壓、代謝綜合征等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］；IL2RB基因主要參與機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)，與2型糖尿病、高血壓及心腦血管事件等相關(guān)［9］；LYN基因?yàn)槔野彼岬鞍准っ?，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［10］；SERPINE1基因上調(diào)使患者易于形成血栓，可見于肥胖、高脂血癥、2型糖尿病等代謝相關(guān)疾病以及乳腺癌等惡性腫瘤和多種感染性疾?。?1-12］。目前，這些基因改變認(rèn)為是不運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致亞健康狀態(tài)男性骨骼肌發(fā)生不利變化、并促進(jìn)其發(fā)生心血管、代謝疾病的核心因素。另一方面，在女性小量高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組篩出的基因中，ECHS1基因?qū)儆谒厦赋易?，?fù)責(zé)線粒體脂肪酸代謝，其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞和病毒復(fù)制［13-14］；DLD基因作為氧化還原酶或蛋白水解酶調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝［15］；SDHC基因作為參與線粒體能量代謝（三羧酸循環(huán)和有氧呼吸鏈）的關(guān)鍵酶，其表達(dá)缺失與多種惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)［16］；ECH1基因?qū)儆谒饷赋易?，其功能與營(yíng)養(yǎng)狀況相關(guān)［17］；ACAA2基因參與線粒體脂肪酸代謝，避免細(xì)胞發(fā)生凋亡［18］；MDH2基因?yàn)榫€粒體內(nèi)參與三羧酸循環(huán)的脫氫酶，其表達(dá)減低或缺失與惡性腫瘤密切相關(guān)［19］；ACADM基因參與線粒體脂肪酸代謝，其異常與多種代謝性疾病相關(guān)［20］；DECR1基因主要在線粒體內(nèi)參與氧化反應(yīng)和脂肪酸代謝［21］；而RETSA基因則參與脂肪形成，在肥胖患者體內(nèi)其表達(dá)下降［22］。本研究結(jié)果顯示這些基因可能是運(yùn)動(dòng)使女性受益、逆轉(zhuǎn)其亞健康狀態(tài)的關(guān)鍵基因。

綜上所述，本研究針對(duì)處于亞健康狀態(tài)的心血管代謝疾病高危人群，基于在線數(shù)據(jù)GSE48278，通過生物信息學(xué)分析其骨骼肌細(xì)胞基因組學(xué)改變，明確了不運(yùn)動(dòng)對(duì)于男性骨骼肌結(jié)構(gòu)與功能的不利影響；并發(fā)現(xiàn)小量運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增強(qiáng)女性骨骼肌有氧代謝并維持骨骼肌的組成與功能。本研究從基因組學(xué)角度，解釋了適量運(yùn)動(dòng)對(duì)亞健康人群的重要性，對(duì)明確如何逆轉(zhuǎn)亞健康狀態(tài)，降低心血管代謝疾病風(fēng)險(xiǎn)提供了重要依據(jù)，具有一定的科學(xué)價(jià)值。