張 穎 王洪濤 張?jiān)蒲?/p>
廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科(廣州 510623)
齲病是人類的常見病、多發(fā)病。通常當(dāng)患者因牙齒齲壞造成不適就診時(shí),病損程度多已達(dá)牙本質(zhì),形成牙本質(zhì)齲,患者可能會(huì)出現(xiàn)牙本質(zhì)敏感、咬合關(guān)系紊亂、牙髓暴露甚至更嚴(yán)重的牙齒折斷等,明顯降低患者的生活質(zhì)量。牙本質(zhì)是牙齒的主體,主要由有機(jī)質(zhì)和無機(jī)質(zhì)組成。在牙本質(zhì)的有機(jī)成分中,約90%為膠原。牙本質(zhì)齲的進(jìn)展主要包括硬組織脫礦和有機(jī)質(zhì)的溶解,有機(jī)質(zhì)的溶解促進(jìn)牙本質(zhì)的脫礦。有機(jī)質(zhì)的溶解與牙本質(zhì)中含有膠原蛋白酶相關(guān)。正常牙本質(zhì)基質(zhì)中存在潛在形式的前膠原蛋白酶,在齲損牙本質(zhì)中,細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物等刺激膠原蛋白酶顯示較高的活性,直接破壞牙本質(zhì)膠原,并加速牙本質(zhì)脫礦,進(jìn)而加快牙本質(zhì)齲病的進(jìn)程[1]。
基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是牙本質(zhì)有機(jī)質(zhì)中含量最多的膠原蛋白酶之一,是降解牙本質(zhì)有機(jī)質(zhì)的主要蛋白水解酶。迄今為止在人類機(jī)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)二十多種,而其中MMP2最早被證明存在于礦化的牙本質(zhì)中,是牙本質(zhì)中含量最多的MMPs,其次為MMP9[2]。因此提示降低MMPs活性是抑制牙本質(zhì)齲進(jìn)展的方法之一。多項(xiàng)研究顯示姜黃素可以抑制腫瘤組織中MMP2、9的活性[3- 4],但姜黃素對(duì)牙本質(zhì)中I型膠原的作用尚未見相關(guān)研究。本課題初步探討姜黃素對(duì)牙本質(zhì)齲進(jìn)展過程中膠原降解程度的影響,為阻止牙本質(zhì)進(jìn)一步齲壞提供新的思路和理論依據(jù)。
取出脫礦的牙本質(zhì)塊,4℃下去離子水?dāng)嚢铔_洗72 h,徹底去除牙塊表面的脫礦液。然后將樣本隨機(jī)為五組:① 10 mmol/LDMSO組;② 2 mmol/L APMA(MPPs激活劑,膠原酶潛酶活化劑)組;③ 2 mmol/L EDTA(MPPs抑制劑)組;④ 姜黃素溶液(姜黃素取3 μmol/L、9 μmol/L、12 μmol/L三種濃度)組。將牙本質(zhì)齲標(biāo)本置于上述各組溶液中24 h,3 d,7 d,14 d,離心后吸取 100 μL的上清液使用Ⅰ型膠原吡啶交聯(lián)終肽(Cross-linked carboxyterminal telopeptide of type I collagen,ICTP)ELISA試劑盒(武漢純度生物, 中國(guó))檢測(cè)ICPT的表達(dá)水平。
將不同組間ICPT的濃度使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析,組間比較用q檢驗(yàn),顯著性標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。
經(jīng)過脫礦液處理后牙本質(zhì)呈瓷白色,表面粗糙,電鏡下見牙本質(zhì)小口完全開放,牙本質(zhì)小管口完全暴露,管口直徑約3 μm,牙本質(zhì)小管排列整齊;未經(jīng)脫礦液處理的牙本質(zhì)呈淡黃色,表面光滑,電鏡下觀察,見牙本質(zhì)小管內(nèi)大量的組織殘?jiān)?,甚至堵塞牙本質(zhì)小管,見圖1。
A.經(jīng)脫礦液處理后牙本質(zhì)表面形態(tài)B.未經(jīng)脫礦液處理的牙本質(zhì)表面形態(tài)圖1 牙本質(zhì)經(jīng)脫礦后表面形態(tài)(×2000)A.經(jīng)脫礦液處理后見牙本質(zhì)小管排列整齊,管內(nèi)清潔,無殘?jiān)? B.未經(jīng)脫礦液處理的牙本質(zhì)小管內(nèi)大量的組織殘?jiān)?甚至堵塞牙本質(zhì)小管
浸泡溶液的成分和浸泡時(shí)間對(duì)ICTP的含量均有影響,見圖2。與APMA相比,牙本質(zhì)齲模型經(jīng)12 μmol/L的姜黃素處理24 h后,ICTP的濃度降至(0.49±0.04)ng/mL,(F=8.459,P<0.05),而且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),ICTP的濃度未見明顯升高。牙本質(zhì)齲模型經(jīng)APMA處理后ICTP濃度升高,且隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),ICTP濃度逐漸增加。與APMA相比,EDTA組ICTP的濃度在24 h后降低,仍高于姜黃素組(F=157.151,P<0.05)。說明姜黃素組能快速、有效地降低ICTP的表達(dá)水平。
圖2 ICPT的檢測(cè)結(jié)果
牙本質(zhì)是牙齒的主體,其化學(xué)組成主要是礦物質(zhì),占其重量的70%,有機(jī)物和水占30%。在牙本質(zhì)有機(jī)成分中,約90%為膠原,以I型膠原含量最多,約占80%。
I型膠原聚集形成直徑約70~90 nm的主纖維,并與直徑約20~40 nm的非膠原蛋白組成的次級(jí)分支纖維相連接,構(gòu)成膠原纖維網(wǎng),其結(jié)構(gòu)的完整性表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)中存在典型67 nm條帶[5]。
正常牙本質(zhì)基質(zhì)中存在潛在形式的前膠原酶,MMPs是牙本質(zhì)有機(jī)質(zhì)中含量最多的膠原蛋白酶之一。MMPs為內(nèi)肽酶,均以潛酶形式分泌,激活后能從肽鏈中間裂解底物,MMPs活性能為相應(yīng)的特異性抑制因子所抑制。MMPs是一組鋅依賴性蛋白酶,在中性條件下可以發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用,有鈣參與時(shí)活性最大,MMPs以無活性的前提形式存在,只用在活化后才能降解細(xì)胞外基質(zhì)[6]。
在齲損牙本質(zhì)中,MMPs顯示較高的活性,可破壞牙本質(zhì)膠原,并加速牙本質(zhì)脫礦[7]。研究顯示牙本質(zhì)中的MMPS以MMP2、MMP9為主,在牙冠部及根部均有分布。在齲壞牙本質(zhì)中MMP2,MMP9的活性增加。此外,牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的MMP2,MMP9明顯增加,加速牙本質(zhì)齲病的進(jìn)程。在治療齲病過程中,由于高速手機(jī)的刺激及口內(nèi)環(huán)境中水、酶等各種因素的影響,暴露的膠原纖維在牙本質(zhì)內(nèi)固有的MMPs等的作用下發(fā)生降解,使混合層的有機(jī)成分損耗,導(dǎo)致粘結(jié)破壞[8];牙本質(zhì)中樹脂粘結(jié)單體擴(kuò)散梯度降低,出現(xiàn)了沿著混合層底部的不完全滲透區(qū)域,部分膠原纖維暴露,MMPs被激活,而未被粘結(jié)樹脂包裹的膠原纖維會(huì)緩慢降解,同樣會(huì)影響樹脂粘結(jié)界面的退行性變,導(dǎo)致充填物脫落,治療失敗[9]。因此抑制牙本質(zhì)中MMPs的活性,減少I型膠原的降解是齲病治療的關(guān)鍵點(diǎn)之一。
目前臨床上主要有兩類MMPs活性抑制劑,分別為局部用藥和全身用藥。局部用藥將藥物直接涂布于患牙處,局部藥物濃度高,抑制MMPs活性的作用顯著,局部常用的抑制MMPs活性制劑主要有EDTA和0.2%醋酸氯己定等。EDTA盡管具有抑制MMPs活性的作用,但其化學(xué)成分促進(jìn)牙本質(zhì)脫礦,副作用較大。0.2%醋酸氯己定體外用于抑制牙本質(zhì)MMPs的濃度大于常用的黏膜消毒濃度(0.05%),外用刺激性大[10]。常用的全身用藥抑制MMPs活性的藥物如巴馬司他、馬立馬司他、MMI- 270等,常用于腫瘤患者,因毒性大、副作用多、外用性質(zhì)不穩(wěn)定、價(jià)格較貴等缺點(diǎn)[11],限制其在牙本質(zhì)齲中的應(yīng)用。因此尋找一種安全、經(jīng)濟(jì)、有效的抑制MMPs活性的藥物,對(duì)齲病的防治顯得尤為重要。
姜黃素是從亞熱帶地區(qū)多年生草本植物姜黃根莖中提取的一種植物多酚,是姜黃中最重要的活性成分,姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)稱,含有2個(gè)酚羥基、2個(gè)甲氧基、2個(gè)不飽和羰基和1個(gè)活潑的亞甲基,這些基團(tuán)都是與生物大分子結(jié)合的潛在位點(diǎn)。同時(shí),姜黃素毒性低,口服吸收少,生物利用度低,可溶于多種溶劑,在低pH值環(huán)境中性質(zhì)仍然穩(wěn)定[12]。這提示姜黃素是一種理想的外用劑型。多項(xiàng)研究顯示姜黃素具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等多方面藥理作用[13]。在腫瘤組織中姜黃素具有抑制MMP2、MMP9的活性,從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移等多種作用[14]。在牙本質(zhì)齲中,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素降低I型膠原降解,在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)姜黃素的濃度大于12 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞具有明顯的毒性。因此本研究中姜黃素的最高濃度選擇 12 μmol/L,當(dāng)姜黃素的濃度小于12 μmol/L時(shí),隨著姜黃素濃度的增加牙本質(zhì)膠原降解的量明顯減少。鑒于姜黃素抑制膠原降解,并可以抑制變形鏈球菌生物膜形成的作用[15],姜黃素具有開發(fā)成為阻止牙本質(zhì)齲進(jìn)一步進(jìn)展的天然藥物的潛能。
將來,我們將進(jìn)一步挖掘姜黃素的藥理作用,開發(fā)姜黃素制劑用于治療和預(yù)防牙本質(zhì)齲。同時(shí),進(jìn)一步研究姜黃素抑制牙本質(zhì)膠原分解的機(jī)制。已有研究表明在不同的腫瘤中姜黃素作用于MMPs的分子機(jī)制不同。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中姜黃素通過p53-E-Cadherin表達(dá),抑制MMP2、MMP9活性,抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[16]。在乳腺癌的模型中,姜黃素通過抑制IκBα激酶活性,抑制IκBα磷酸化和降解,從而通過抑制NF-κB通路,降低MMP2、MMP9的表達(dá)和活性[17]。姜黃素加入肝癌細(xì)胞培養(yǎng)液中,抑制AKT 和STAT3磷酸化,抑制MMP9活性,從而抑制血管生成[18]。在牙體硬組織中姜黃素作用的具體分子機(jī)制不明,我們將進(jìn)一步深入研究,豐富姜黃素的作用機(jī)理。