詹 琪 繆 旋 聶玉強

廣州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(廣州510180)

肝臟的再生能力是肝損傷后肝功能恢復正常的重要保障機制。小鼠的肝大部分切除術(shù)(partial hepatectomy，PHx)是研究肝再生的主要動物模型[1]，PHx術(shù)后肝內(nèi)枯否細胞(kupffer cell，KC)被激活[2]，后者釋放大量炎癥因子誘導肝細胞進入增殖周期，啟動肝再生。

核受體Nur77是調(diào)控癌基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，與細胞增殖和凋亡均密切相關[3]，在前列腺、胃及胰腺惡性腫瘤中均表達上調(diào)[4- 6]。然而我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Nur77基因缺失小鼠PHx術(shù)后早期肝再生的進程加速，同時Nur77的靶基因PAI-1的表達下調(diào)，提示Nur77及其下游基因?qū)Ω卧偕缙诘拇僭鲋承盘柾菲鹨种谱饔肹7]。本研究進一步深入探討Nur77及其下游通路對肝再生早期肝臟細胞增殖的調(diào)控機制，為研究肝再生過程中復雜精準的信號網(wǎng)絡提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Nur77基因敲除(knockout, KO)C57BL/6小鼠(由加州大學Wan教授惠贈)及野生型(wild type, WT)對照，均為12～14周齡，體質(zhì)量范圍18.6～24.1 g，其中WT組(21.2±1.21)g，KO組(20.9±1.01)g，兩組小鼠體質(zhì)量無差異。各組設PHx術(shù)后1 h、3 h、8 h、24 h、36 h、48 h和72 h，每個時間點5只小鼠，每組共35只小鼠[8]。本研究涉及的與動物實驗相關的內(nèi)容與程序經(jīng)華南理工大學實驗動物中心倫理委員會審核，遵從實驗動物使用和管理的相關法律法規(guī)，保證實驗動物的福利，動物倫理學編號(2017005)。

1.2 實驗材料與試劑

TUNEL試劑盒購自Thermo Scientific 公司，real-time PCR Power SYBR@Green PCR Master Mix、cDNA試劑盒、均購自Life Technologies公司。Cleaved Caspase-3抗體、β-actin抗體等購自Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 PHx手術(shù)方法參考作者已發(fā)表文章[8]

1.3.2 Real-time PCR：取50 mg肝組織，用Trizol試劑提取總RNA，Bioanalyzer 2100測定RNA濃度和純度。cDNA制備：用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號4374967)，取1 μg總RNA按試劑盒說明書制備20 μL反應體系，反應條件為25℃ 10min，37℃ 2 h，85℃5min，4℃長期保存。用Primer3web設計小鼠caspase-8基因引物序列。引物、cDNA與Power SYBR@Green Master Mix混合成20 μL反應體系，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt值法計算相對基因表達量。Ct值來自于3次獨立試驗的均值。

1.3.3 末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)和血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測。 按In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red (德國Roche公司)說明書所示，細胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI, Invitrogen,美國)。計數(shù)在熒光顯微鏡下呈紅色熒光的細胞核，最少5個高倍視野(40×)。血清在-20℃ 保存，使用Liquid ALT Reagent試劑盒測定血清ALT濃度。

1.3.4 Western-blot：肝組織勻漿(40 μg)用聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳分離并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉抗原，與Cleaved Caspase-3單克隆抗體4℃搖床緩慢孵育過夜，洗滌液洗滌室溫10min 5次，與HRP標記的二抗4℃搖床緩慢孵育 1 h，洗滌液洗滌室溫10min 5次，BeyoECL Plus試劑盒顯影，并用Scion Image軟件量化蛋白條帶密度，以內(nèi)參蛋白β-actin為參照計算Cleaved Caspase-3蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)用EXCEL軟件進行處理分析；兩組凋亡細胞核計數(shù)、血清ALT濃度、定量PCR以及蛋白相對表達量結(jié)果比較用成組t檢驗，P<0.05 被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Nur77基因敲除小鼠肝再生過程出現(xiàn)肝細胞壞死

PHx術(shù)后所有小鼠均存活至指定時間點，按各時間點處理小鼠，通過對兩組各時間點的肝組織蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin HE)染色并觀察，見圖1，KO組PHx術(shù)后各時間點均發(fā)現(xiàn)肝組織局灶性壞死。兩組發(fā)生肝壞死的例數(shù)統(tǒng)計見表1，KO組在PHx術(shù)后72小時內(nèi)共有11只個體出現(xiàn)肝壞死，占比約30%，高于對照組。

表1肝大部分切除術(shù)后肝損傷發(fā)生率

兩組小鼠的血清ALT檢測結(jié)果顯示KO組術(shù)后48 h和72 h血清ALT水平高于對照組(466.3±202.4 vs 72.0±58.8，t=4.18,P=0.009;486.2±156.3 vs 63.0±0.3，t=6.06P=0.004)圖1B,提示KO組在肝再生過程中存在肝損傷。

圖1 PHx術(shù)后各時間點肝壞死情況注：A：小鼠肝組織HE染色(×40)補充放大倍數(shù)；B：#：P < 0.01

2.2 Nur77基因缺失誘導再生肝細胞凋亡

為進一步闡釋Nur77對誘導KO組肝再生過程中發(fā)生肝壞死的分子機制，作者用TUNEL試劑盒對肝組織進行凋亡特異性染色。見圖2， KO組術(shù)后3 h和48 h肝組織內(nèi)凋亡細胞核計數(shù)高于對照組(38.7±9.6 vs 2.8±0.2，t=8.23,P=0.001；87.3±19.4 vs 8.4±3.1，t=8.96,P=0.001)。提示Nur77缺失導致小鼠肝再生過程發(fā)生細胞凋亡。

圖2 PHx術(shù)后3小時、48小時肝細胞凋亡情況注：A：凋亡細胞經(jīng)DAP-I染色后鏡下呈亮紅色；B：計數(shù)5個高倍視野(×60)內(nèi)凋亡細胞數(shù)；C：PHx術(shù)后各時間點小鼠肝內(nèi)caspase8基因mRNA；D：剪切的caspase3蛋白水平。#：P<0.05；##：P<0.001。

兩組肝組織中凋亡基因caspase-8的mRNA水平見圖2 C所示，PHx術(shù)后1、3、8、24 h KO組caspase-8基因的mRNA水平高于對照組(2.68±0.53 vs 1.88±0.18,t=3.19，P=0.012；5.16±0.85 vs 1.98±0.25,t=8.08，P<0.01；4.34±0.43 vs 2.24±0.47，t=7.38，P<0.01；2.46±0.49 vs 1.35±0.26，t=4.11，P<0.01)。剪切的caspase-3蛋白水平用來衡量組織中細胞凋亡的程度，我們用蛋白免疫印跡檢測再生肝組織中剪切caspase-3蛋白表達量，見圖2D，PHx術(shù)后3、8、24、48 h KO組肝內(nèi)剪切caspase-3蛋白高于對照組(10.35±3.95 vs 2.34±1.20,t=4.33，P=0.008；7.24±2.47 vs 0.51±0.20，t=6.02，P=0.003；13.04±4.77 vs 3.39±2.03,t=4.16，P=0.007；13.56±5.56 vs 0.60±0.57，t=5.19，P=0.006)，提示KO組肝臟再生過程中發(fā)生肝細胞凋亡。

3 討 論

肝臟具有強大的再生能力，發(fā)揮并放大肝臟的再生能力，能最大限度的提高肝臟切除術(shù)后或者急性肝衰竭患者的存活率[9]。肝再生的早期階段是一個“肝臟免疫細胞活化——炎癥因子釋放——免疫再激活”的級聯(lián)放大的炎癥反應過程[10- 12]。然而大量活化的免疫細胞和炎癥因子在調(diào)控肝細胞進入增殖周期的同時又能夠避免對肝組織的炎癥損傷，需要有一種“選擇機制”精準的切換增殖與死亡相關信號通路的激活。

我們在研究Nur77對肝再生調(diào)控機制的過程中發(fā)現(xiàn)：該基因的缺失導致肝再生早期進程加速，且肝細胞提前進入分裂周期，提示Nur77可能通過其下游信號通路抑制肝再生的細胞增殖[8]。然而我們進一步研究發(fā)現(xiàn)，KO組30%的小鼠發(fā)生組織壞死及肝損傷，進一步凋亡特異性染色發(fā)現(xiàn)KO組肝組織中凋亡細胞數(shù)量顯著增加，提示Nur77基因缺失誘導小鼠再生肝臟凋亡及肝損傷。Nur77基因敲除小鼠肝臟再生過程中這種“細胞損傷”與“細胞增殖”并存的現(xiàn)象說明Nur77可能是肝再生過程中維持“炎癥損傷-細胞增殖”穩(wěn)態(tài)的關鍵因子，因此我們假設Nur77通過調(diào)控肝再生早期炎癥因子信號通路的下游基因表達，并通過其核-漿轉(zhuǎn)運機制實現(xiàn)細胞增殖或者凋亡的效應[13- 14]。

Nur77的核-漿轉(zhuǎn)運與凋亡蛋白caspase-3和caspase-8的表達與活化密切相關[15- 17]，為了進一步驗證Nur77缺失誘導小鼠再生肝臟凋亡的分子機制，我們分別從mRNA和蛋白水平檢測肝再生進程中肝細胞的凋亡過程。結(jié)果顯示KO組肝臟在PHx術(shù)后3小時，凋亡基因caspase-8及剪切的caspase-3蛋白水平即顯著上調(diào)并持續(xù)至術(shù)后48小時。這一結(jié)果與組織學及血清學改變相一致，后者于術(shù)后48至72小時達峰值。然而實驗中肝損害與細胞凋亡并非完全一致，部分肝損害個體出現(xiàn)在術(shù)后1至3小時，此時肝臟凋亡基因表達開始上調(diào)，提示肝細胞凋亡繼發(fā)于肝損害。肝內(nèi)KC細胞的激活是肝再生啟動的關鍵機制[18- 19]，PHx術(shù)后門靜脈內(nèi)快速增多的脂多糖(LPS)誘導腫瘤壞死因子α(TNFα)上調(diào)，后者激活肝內(nèi)KC細胞，活化的KC細胞釋放大量炎癥介質(zhì)誘導肝細胞增殖,而Nur77缺失與巨噬細胞的過度激活密切相關[20]，進而導致再生肝臟出現(xiàn)炎癥損傷。

綜上所述，核受體Nur77可能是調(diào)控肝再生過程中“增殖-凋亡”穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控因子，進一步研究將有助于闡釋調(diào)控肝再生這一精準且復雜過程的信號網(wǎng)絡。