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        北沙參多糖復(fù)合酶提取工藝及理化性質(zhì)研究

        2019-12-19 07:48:56景永帥張丹參張瑞娟劉東波鄭玉光吳蘭芳
        食品與機械 2019年11期
        關(guān)鍵詞:北沙參木瓜液料

        景永帥 - 張丹參 - 張瑞娟 - 韓 鈺 劉東波 - 鄭玉光 - 吳蘭芳 -

        (1. 河北科技大學化學與制藥工程學院,河北 石家莊 050018;2. 河北中醫(yī)學院藥學院,河北 石家莊 050200)

        北沙參為傘形科植物珊瑚菜(GlehniaLittoralisFr. Schmidt ex Miq.)的干燥根,是傳統(tǒng)的名貴藥材和藥食同源物品,具有滋陰清肺、益胃生津等功效[1-2]。其有效成分主要為香豆素類、聚炔類及多糖類物質(zhì),其中多糖類含量最高,具有抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等功能[3-4]。

        北沙參多糖提取方法主要有熱水回流提取法[5]、微波輔助提取法[3]、超聲波輔助提取法[6]、酸堿提取法[7]、酶提取法[7]等。酶提取法因其提取條件溫和,可加速有效成分釋放、純化提取液中的提取物等特點,已被廣泛應(yīng)用于植物中有效成分的提取[8-10]。常用的酶有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶或復(fù)合酶。纖維素是細胞壁的主要成分,也是多糖溶出的主要屏障,利用纖維素酶水解細胞壁,可加速多糖的溶出,且對細胞內(nèi)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)無影響;木瓜蛋白酶是含巰基肽鏈的內(nèi)切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性,可水解蛋白質(zhì),幫助多糖溶出[11]。使用單一酶提取北沙參多糖已有研究[7],而研究采用復(fù)合酶提取北沙參多糖較少[12]。

        試驗擬選用纖維素酶和木瓜蛋白酶按一定比例進行北沙參多糖提取,應(yīng)用響應(yīng)面法確定最佳提取工藝,并對其結(jié)構(gòu)特征進行分析,考察其對DPPH自由基的清除作用,為提高北沙參多糖的提取率及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        北沙參:產(chǎn)自河北保定,亳州市問善堂藥業(yè)科技有限公司;

        1,1-二苯基-2-苦味基肼(DPPH)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)、DEAE-52纖維素:色譜純,上海阿拉丁試劑有限公司;

        纖維素酶:1×105U/g,寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司;

        木瓜蛋白酶:1×105U/g,南寧龐博生物工程有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        恒溫水浴鍋:HH-2型,江蘇金壇宏華儀器廠;

        磁力加熱攪拌器:DF-2型,江蘇金壇宏華儀器廠;

        旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:EYELAN-1100型,日本東京理化株式會社;

        超聲波清洗器:KS-300DE型,昆山潔力美超聲儀器有限公司;

        傅里葉變換紅外光譜儀:S-100型,德國珀金埃爾默公司;

        TSK-GEL凝膠柱:G4000 PWXL、G2500 PWXL型,日本東京株式會社;

        液相色譜儀:LC1220型,安捷倫科技(中國)有限公司;

        液相色譜儀:e2695型,美國Alliance公司。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 北沙參預(yù)處理 取北沙參粉碎,過40目篩,用3倍體積的95%乙醇回流提取2次,除去脂溶性成分,藥渣干燥后,備用。

        1.3.2 北沙參多糖提取工藝優(yōu)化

        (1) 酶解時間:取5 g經(jīng)預(yù)處理的北沙參粉末,酶解溫度70 ℃,液料比20∶1 (mL/g),纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比1∶1,酶添加量1%(質(zhì)量分數(shù)),考察酶解時間(1,2,3,4 h)對多糖提取率的影響。

        (2) 酶解溫度:取5 g經(jīng)預(yù)處理的北沙參粉末,液料比20∶1 (mL/g),纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比1∶1,酶添加量1%(質(zhì)量分數(shù)),酶解2 h,考察酶解溫度(40,50,60,70,80 ℃)對多糖提取率的影響。

        (3) 液料比:取5 g經(jīng)預(yù)處理的北沙參粉末,酶解溫度70 ℃,纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比1∶1,酶添加量1%(質(zhì)量分數(shù)),酶解3 h,考察液料比[20∶1,30∶1,40∶1,50∶1 (mL/g)]對多糖提取率的影響。

        (4) 酶添加量:取5 g經(jīng)預(yù)處理的北沙參粉末,酶解溫度70 ℃,液料比30∶1 (mL/g),纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比3∶1,酶解3 h,考察酶添加量(1%,2%,3%,4%,質(zhì)量分數(shù))對多糖提取率的影響。

        (5) 纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比:取5 g經(jīng)預(yù)處理的北沙參粉末,酶解溫度70 ℃,液料比30∶1 (mL/g),酶添加量1%(質(zhì)量分數(shù)),酶解3 h,考察纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比(1∶1,1∶2,2∶1,1∶3,3∶1)對多糖提取率的影響。

        (6) 響應(yīng)面試驗優(yōu)化:根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理,選取酶解時間、液料比和酶添加量為響應(yīng)面因素,利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計優(yōu)化提取工藝,并對結(jié)果進行分析。

        1.3.3 多糖提取率的測定 按式(1)計算多糖提取率。

        (1)

        式中:

        E——多糖提取率,%;

        C1——粗多糖質(zhì)量,g;

        C2——樣品質(zhì)量,g。

        1.3.4 分離純化 采用DEAE-52纖維素柱層析法對北沙參粗多糖進行分離純化。取北沙參多糖(GLP-E)約200 mg,加入10 mL蒸餾水溶解,離心,上樣,分別以蒸餾水和0~1 mol/L NaCl洗脫,并用自動收集器收集,每10 min 收集一管,苯酚—硫酸法顯色。

        1.3.5 理化性質(zhì)分析

        (1) 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析:檢測北沙參多糖在4 000~450 cm-1處的FT-IR[13]。

        (2) 北沙參多糖相對分子質(zhì)量:采用HPGPC-ELSD法[14]。以保留時間為橫坐標,相對分子質(zhì)量為縱坐標,繪制標準葡聚糖標準曲線(y=-0.310 8x+11.749,R2=0.991 1),根據(jù)標準曲線計算北沙參多糖相對分子質(zhì)量。色譜柱為TSK-GEL G4000 PWXL、TSK-GEL G2500 PWXL;流動相為超純水;柱溫30 ℃;進樣量20 μL;漂移管溫度60 ℃;霧化溫度30 ℃;載氣為N2;載氣流量2.0 mL/min。

        (3) HPLC分析:根據(jù)文獻[15]略作修改。Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);檢測波長245 nm;柱溫30 ℃;上樣量20 μL;流速1 mL/min;流動相為磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 6.85)—乙腈(83∶17,體積比);洗脫方式為等度洗脫。

        1.3.6 清除DPPH自由基能力 參照文獻[16-17]。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        采用Design-Expert 8.0、Origin 8、SPSS 16.0和Excel等分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗

        2.1.1 酶解時間對北沙參多糖提取率的影響 由圖1可知,隨著酶解時間的增加,提取率總體呈先增后減趨勢,酶解3 h時提取率達峰值,可能是隨著酶解時間的增長,酶解作用充分發(fā)揮,使得提取率增大,但時間過長,部分多糖被酶解導(dǎo)致提取率降低。因此,選擇酶解3 h。

        圖1 酶解時間對北沙參多糖提取率的影響

        2.1.2 酶解溫度對北沙參多糖提取率的影響 由圖2可知,30~70 ℃時提取率隨酶解溫度的升高而上升;溫度繼續(xù)升高,提取率下降。隨著溫度的升高,多糖在溶劑中的溶解度、擴散系數(shù)增大,提取率增加;溫度過高,多糖結(jié)構(gòu)受到破壞,且酶逐漸失活,提取率降低。因此,選擇酶解溫度為70 ℃。

        2.1.3 液料比對北沙參多糖提取率的影響 由圖3可知,當液料比為30∶1 (mL/g)時,提取率最高,繼續(xù)增大液料比,提取率反而降低,其原因可能與液料比過高不利于多糖溶出有關(guān)。因此,選擇液料比為30∶1 (mL/g)。

        圖2 酶解溫度對北沙參多糖提取率的影響

        Figure 2 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of polysaccharide fromGlehniaeRadix

        圖3 液料比對北沙參多糖提取率的影響

        Figure 3 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction rate of polysaccharide fromGlehniaeRadix

        2.1.4 酶添加量對北沙參多糖提取率的影響 由圖4可知,北沙參多糖提取率隨著酶添加量的增加先上升后下降,當酶添加量為3%時,提取率最高,可能是在一定范圍內(nèi),增加酶的用量有利于水解植物細胞組織,從而利于多糖的溶出;當酶添加量繼續(xù)增加時,北沙參多糖被過量的纖維素酶和木瓜蛋白酶降解,導(dǎo)致提取率降低。因此,選擇酶添加量為3%。

        2.1.5 纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比對多糖提取率的影響 由圖5可知,當纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比為3∶1時,多糖提取率最高達21.9%;當纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比為1∶3時,多糖提取率最低為12.7%,二者之間存在顯著差異??赡苁敲阜N類不同,作用位點不同,纖維素酶可水解細胞壁,木瓜蛋白酶可水解蛋白質(zhì),有助于多糖溶出,當二者以適當比例復(fù)合時,才能顯著提高多糖提取率。因此,選擇纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比為3∶1。

        圖4 酶添加量對多糖提取率的影響

        圖5 酶比對多糖提取率的影響

        2.2 Box-Behnken試驗結(jié)果

        采用Box-Behnken Design試驗設(shè)計方法,通過響應(yīng)面分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)[18]。根據(jù)單因素試驗結(jié)果,確定多糖酶解時間、液料比、酶添加量的各項參數(shù)水平(見表1)。采用Box-Behnken設(shè)計對北沙參多糖提取進行工藝優(yōu)化,結(jié)果見表2。

        由軟件分析所得各因素和響應(yīng)值關(guān)系的二次多元回歸方程為:

        Y=22.23+0.069A+0.17B-0.71C-0.34AB+0.93AC+0.40BC-1.36A2-2.26B2-2.12C2。

        (2)

        表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平表

        表2 試驗設(shè)計及結(jié)果

        表3 回歸模型方差分析?

        2.3 等高線圖和響應(yīng)曲面圖

        由圖6~8可知,各等高線圖均呈橢圓形,說明酶解時間與液料比、酶解時間與酶添加量、液料比與酶添加量之間存在交互作用。

        2.4 模型的驗證

        通過Design-Expert 8.0軟件分析,北沙參多糖提取的最佳工藝條件為酶解時間2.98 h,液料比30.12∶1(mL/g),酶添加量2.91%,為檢測該法的可靠性,考慮到實際操作的便利,最優(yōu)工藝修正為酶解時間3 h,液料比30∶1 (mL/g),酶添加量3%,進行3次驗證實驗,北沙參多糖提取率為(22.04±0.23)%,與預(yù)測值22.30%相差0.25%,說明用該模型對北沙參多糖的提取進行工藝優(yōu)化具有一定的實際可操作性。該條件下的北沙參多糖提取率(22.04%)高于課題組前期研究[6]的(12.13%),說明復(fù)合酶法提取多糖,有更好的協(xié)同作用,效率更高。

        2.5 北沙參粗多糖分離純化

        由圖9可知,蒸餾水和NaCl作為洗脫相,均有一個洗脫峰,分別命名為GLP-E1、GLP-E2。

        2.6 GLP-E、GLP-E1、GLP-E2理化性質(zhì)分析

        圖6 酶解時間與液料比對多糖提取率的交互作用

        圖7 酶解時間與酶添加量對多糖提取率的交互作用

        圖8 液料比與酶添加量對多糖提取率的交互作用

        圖9 北沙參粗多糖DEAE-52纖維素洗脫曲線圖

        2.6.2 單糖組成 由圖11可知,GLP-E由GlcA、Glc、Gal和Ara組成;GLP-E1由GlcA、Glc、Gal和Ara組成;GLP-E2由Glc組成。

        2.6.3 相對分子質(zhì)量 由圖12可知,GLP-E具有3個吸

        圖10 GLP-E、GLP-E1、GLP-E2紅外圖譜

        1. Man 2. Rha 3. GlcA 4. GalA 5. Glc 6. Gal 7. Xyl8. Ara 9. Fuc

        圖12 GLP-E、GLP-E1、GLP-E2相對分子質(zhì)量分布圖

        收峰,相對分子質(zhì)量分別為4 662.98,376.89,10.40 kDa;GLP-E1具有2個吸收峰,相對分子質(zhì)量分別為4 221.45,377.96 kDa;GLP-E2具有2個吸收峰,相對分子質(zhì)量分別為4 626.41,10.24 kDa。由此可見,GLP-E、GLP-E1和GLP-E2為非均一多糖。

        2.7 體外抗氧化活性

        由圖13可知,在0~8 mg/mL濃度范圍內(nèi),GLP-E、GLP-E1、GLP-E2對DPPH自由基有一定的清除作用,且呈濃度依賴性。三者清除DPPH自由基的IC50值分別為1.918,7.422,3.392 mg/mL,清除能力大小為GLP-E>GLP-E2>GLP-E1,優(yōu)于超聲波輔助提取法的(1.99 mg/mL)[7]和纖維素酶法的(6.317 mg/mL)[8],但均低于陽性對照VC(IC50為0.005 mg/mL)的清除能力。

        圖13 GLP-E、GLP-E1和GLP-E2對DPPH自由基的清除作用

        李亞輝等[21]研究表明復(fù)合酶提取的多糖對DPPH自由基和羥基自由基的清除作用均略大于同質(zhì)量濃度的VC。故復(fù)合酶法提取的多糖具有較好的抗氧化作用,可能由于:① 雙重酶解作用,有利于多糖的溶出;② 提取時間短、條件溫和,對多糖的結(jié)構(gòu)破壞較小;③ 木瓜蛋白酶水解蛋白質(zhì),多糖溶出的同時,提高了多糖的純度[22]。

        3 結(jié)論

        通過單因素試驗及響應(yīng)面綜合分析,得到復(fù)合酶法提取北沙參多糖的最優(yōu)提取工藝為酶解溫度70 ℃,酶解時間3 h,液料比30∶1 (mL/g),酶添加量3%,纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比3∶1,此條件下的提取率為(22.04±0.23)%。經(jīng)DEAE-52纖維素純化后得到兩個組分,GLP-E1 與GLP-E2。GLP-E由GlcA、Glc、Gal和Ara組成,相對分子質(zhì)量分別為4 662.98,376.88,10.40 kDa;GLP-E1由GlcA、Glc、Gal和Ara組成,相對分子質(zhì)量分別為4 221.45,377.96 kDa;GLP-E2由Glc組成,相對分子質(zhì)量分別為4 626.41,10.24 kDa;且3種組分均表現(xiàn)出一定的清除DPPH自由基的能力,其IC50值分別為1.918,7.422,3.392 mg/mL。后期將對北沙參多糖的結(jié)構(gòu)特征及體內(nèi)抗氧化活性進行研究。

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