高 瑾 Manonose - - 李志豪 -王 萍 余雄偉 - 李述剛 -

(1. 湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430000；2. 塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；3. 武漢旭東有限公司，湖北 武漢 430000)

籽瓜(Citrulluslanatusvar)俗稱“打瓜”，是西瓜(Citrulluslanatus)的變種，為葫蘆科西瓜屬植物，其種子常被稱為西瓜子或黑瓜子。籽瓜種仁中蛋白質(zhì)含量為36%～40%，其中必需氨基酸含量較為豐富，除賴氨酸外，其他幾種必需氨基酸(如色氨酸、苯丙氨酸等)含量均符合或超過FAO推薦的比例[1-2]。

丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是一種活性醛類物質(zhì)，能引起蛋白質(zhì)、多糖、核酸等生命大分子的交聯(lián)反應(yīng)形成聚合物，同時可通過MDA含量了解脂質(zhì)過氧化程度[3]。籽瓜種仁在加工、儲藏等過程中極易受到光、氧、熱等影響而發(fā)生脂質(zhì)過氧化，MDA是油脂氧化過程中的一種重要的氧化產(chǎn)物，對其產(chǎn)品風味、營養(yǎng)等會產(chǎn)生較大負面影響。籽瓜種子中油脂的含量為45%左右，亞油酸、棕櫚酸及硬脂酸是其主要成分[4]。籽瓜種仁蛋白質(zhì)的研究主要集中在提取工藝、蛋白質(zhì)組成及功能特性上[5]，而油脂氧化尤其是脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)方面的研究尚未見報道。

試驗擬以籽瓜種仁蛋白質(zhì)為研究對象，采用圓二色光譜、質(zhì)構(gòu)等技術(shù)揭示MDA氧化對籽瓜種仁蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性及功能特性的影響，為籽瓜種仁蛋白質(zhì)產(chǎn)品在實際工業(yè)生產(chǎn)中的精加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

籽瓜種仁：產(chǎn)地新疆；

透析袋：8 000～14 000 Da，美國Biosharp公司；

1,1,3,3-四甲氧基丙烷(1,1,3,3-Tetramethoxypropane, TMP)、8-苯胺基-1-萘磺酸(8-Anilino-l-naphthalcncsulfonic acid, ANS)：分析純，美國Sigma公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機：Micro 21R型，美國Thermo Fisher公司；

傅里葉紅外光譜儀：Nicoletis50型，美國Thermo Fisher公司；

圓二色譜儀：J-1500型，日本JASCO公司；

熒光分光光度計：F4600型，日本日立公司；

電泳儀：DYY-8C型，北京六一生物科技有限公司；

納米粒度分析儀：Nano ZS型，英國Malvern公司；

掃描電子顯微鏡：SU-8010型，日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 籽瓜蛋白的制備 參照毛曉英[6]的方法。

1.2.2 MDA的制備 通過水解1,1,3,3-四甲氧基丙烷(TMP)制備新鮮的MDA儲備溶液[7]。將8.4 mL TMP與10.0 mL 5.0 mol/L HCl和31.6 mL去離子水混合，40 ℃ 暗處搖晃30 min，獲得MDA，用6 mol/L NaOH將溶液pH調(diào)至7.4，儲備溶液中MDA濃度通過吸光度在267 nm 處估算，摩爾消光系數(shù)值為31 500 L/(mol·cm)。

1.2.3 氧化籽瓜種仁蛋白質(zhì)的制備 參照Wu等[7]的方法，將一定量的MDA與籽瓜種仁蛋白質(zhì)溶液(50 mg/mL)混合，MDA終濃度梯度為0.00，0.01，0.10，1.00，10.00，100.00 mmol/L，25 ℃密封避光條件下振蕩24 h，透析24 h后冷凍干燥，于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 巰基和二硫鍵含量的測定 采用DNTB比色法[8]。

1.2.5 表面疏水性的測定 采用ANS熒光探針法[8]。

1.2.6 二級結(jié)構(gòu)的測定 參照Wu等[7]的方法，將籽瓜種仁蛋白質(zhì)上清溶液稀釋成終濃度為50 μg/mL，利用MOS-450圓二色光譜儀進行檢測。

1.2.7 傅里葉紅外光譜分析 參考Liu等[9]的方法。在室溫、干燥環(huán)境下將2 mg氧化籽瓜種仁蛋白質(zhì)樣品與200 mg KBr研磨混合均勻后壓片。掃描波數(shù)400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)128次。

1.2.8 聚丙烯酰胺凝膠電泳 參考Laemmli[10]的方法。將籽瓜種仁蛋白質(zhì)樣品溶于0.01 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，使樣品最終濃度為1.5 mg/mL，上樣量10 μL。電泳凝膠板0.75 mm，初始電流10 mA，樣品進入分離膠后電流25 mA。

1.2.9 粒徑分布 參考Huang等[8]的方法。

1.2.10 微觀結(jié)構(gòu) 參照張海華等[11]的方法，取少量籽瓜種仁蛋白質(zhì)樣品過100目篩，采用掃描電子顯微鏡(SEM)進行觀察。

1.2.11 持水性和持油性的測定 參考吳偉等[12]的方法。

1.2.12 凝膠特性的檢測 利用超純水將氧化后的蛋白質(zhì)配置成90 mg/mL蛋白溶液，根據(jù)前期預試驗調(diào)整布丁制作配方：0.25 g卡拉膠，0.09 g蔗糖脂肪酸酯，0.125 g果膠，4 g奶粉，3.5 g白砂糖，42.5 g氧化籽瓜種仁蛋白質(zhì)溶液。將制作的布丁產(chǎn)品4 ℃下存放12 h后測其質(zhì)構(gòu)。測定模式為TPA模式[13]，探頭型號SMS/P36R，測前速率5.00 mm/s，測試速率1 mm/s，測后速率1 mm/s，停留時間10 s，下壓形變40%，觸發(fā)力5 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果表示為(平均值±標準偏差)，采用SPSS 17.0分析軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，利用Origin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巰基和二硫鍵含量

由表1可知，隨MDA濃度的增加，籽瓜種仁蛋白質(zhì)總巰基含量下降，二硫鍵含量上升，可能是蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈在MDA作用下形成共價交聯(lián)，導致巰基含量損失，二硫鍵數(shù)量及分布改變，與Wu等[4]的研究結(jié)果類似。因此，MDA氧化后的籽瓜種仁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

2.2 表面疏水性

由圖1可知，籽瓜種仁蛋白質(zhì)表面疏水性隨MDA終濃度的增大而減小(P<0.05)，可能是蛋白質(zhì)構(gòu)象在MDA氧化作用下先展開后又重新組合，導致親水基團增加，疏水基團減少或者是蛋白質(zhì)聚集，掩埋疏水基團，使其含量下降。王丹丹等[14]研究表明，核桃蛋白表面疏水性隨氧化程度的加深逐漸降低。

2.3 圓二色光譜

由表2可知，氧化后的籽瓜種仁蛋白質(zhì)的α-螺旋含量減少，β-折疊含量上升，β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲含量下降，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由氨基酸的局部序列和分子間不同部位的相互作用決定[15]，上述結(jié)果表明氧化會在一定程度上破壞籽瓜種仁蛋白質(zhì)分子間的相互作用，進而改變二級結(jié)構(gòu)。

表1不同濃度MDA氧化對籽瓜種仁蛋白質(zhì)總巰基及二硫鍵含量的影響?

Table 1 Effects of MDA oxidation at different concentrations on the content of total sulfydryl group and disulfide bond of seeds-watermelon seed protein

MDA濃度/(mmol·L-1)總巰基/(Cund·mg-1)二硫鍵/(Cund·mg-1)0.0048.02±0.73d18.56±0.37a0.0146.06±0.50c19.55±0.25b0.1044.57±1.06b20.29±0.53c1.0043.20±0.94b20.98±0.47c10.0041.18±0.24b21.98±0.45c100.0039.70±0.18a22.73±0.39d

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 Effects of MDA oxidation at different concentrations on surface hydrophobicity of seeds-watermelon seed protein

表2 不同濃度MDA氧化對籽瓜種仁蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響?

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 傅里葉紅外光譜

2.5 凝膠電泳

由圖3可知，在非還原情況下，35～260 kDa的條帶濃度隨MDA濃度的升高而增加；在MDA濃度為100.00 mmol/L時，高分子量聚集體在凝膠頂端發(fā)生積聚且逐漸加深，表明籽瓜種仁蛋白質(zhì)受到氧化而產(chǎn)生聚集，且聚集程度隨蛋白質(zhì)氧化程度的加深而不斷增加。Chen等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，油脂氧化產(chǎn)物作用于大豆分離蛋白可導致非二硫鍵誘導的聚集產(chǎn)生，并認為這種聚集是由非二硫鍵的共價鍵引起的。因此，籽瓜種仁蛋白質(zhì)在氧化過程中，分子量的改變也會對其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進而改變蛋白質(zhì)的功能特性。

圖2 不同濃度MDA氧化籽瓜種仁蛋白質(zhì)的傅里葉紅外光譜分析

Figure 2 Fourier infrared spectrum analysis of seeds-watermelon seed protein oxidized by MDA at different concentrations

2.6 粒徑分布

由圖4可知，MDA氧化與天然的籽瓜種仁蛋白質(zhì)粒徑均呈單峰分布，峰值大多出現(xiàn)在 100.00 nm左右；當MDA濃度為1.00 mmol/L時，粒徑增大至150 nm，可能是低濃度氧化誘使籽瓜種仁蛋白質(zhì)形成了氧化聚集體，蛋白質(zhì)粒徑分布增大；當MDA濃度為100.00 mmol/L時，籽瓜種仁蛋白質(zhì)溶液中一些較大的可溶性聚集體在共價和非共價鍵的直接相互作用下轉(zhuǎn)變成不溶性組分，小的可溶性聚集體斷裂為更小的小分子多肽，將氧化后的籽瓜種仁蛋白質(zhì)溶液離心后，其粒徑減小。由此表明MDA氧化促使籽瓜種仁蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，不可溶性蛋白質(zhì)組分含量提高，蛋白質(zhì)溶解度降低。

1. 蛋白Marker 2～7. 分別為100.00，10.00，1.00，0.10，0.01，0.00 mmol/L MDA氧化后的籽瓜種仁蛋白樣品

圖3 經(jīng)不同濃度MDA氧化后籽瓜種仁蛋白質(zhì)凝膠電泳圖

Figure 3 Protein gel electrophoresis of seeds-watermelon seed protein after MDA oxidation at different concentrations

圖4 不同濃度MDA氧化籽瓜種仁蛋白粒徑分析

Figure 4 Particle size analysis of seeds-watermelon seed protein oxidized by MDA at different concentrations

2.7 微觀結(jié)構(gòu)

由圖5可知，未氧化的籽瓜種仁蛋白質(zhì)顯示出比較致密的結(jié)構(gòu)，氧化后的結(jié)構(gòu)較為疏松，且隨MDA濃度的增大出現(xiàn)較多的顆粒狀結(jié)構(gòu)，可能是籽瓜種仁蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)在氧化后會發(fā)生去折疊，分子間聚集，從而使表面結(jié)構(gòu)改變[18]。

圖5 不同濃度MDA氧化籽瓜種仁蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)

Figure 5 The microstructure of seeds-watermelon seed protein oxidized by MDA at different concentrations

2.8 持水性

由圖6可知，籽瓜種仁蛋白質(zhì)的持水性隨MDA濃度的增大先下降后上升，但均高于天然籽瓜種仁蛋白質(zhì)的。當MDA濃度較低時，籽瓜種仁蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基與MDA接觸并反應(yīng)，使得籽瓜種仁蛋白質(zhì)部分去折疊，疏水基團外露，持水性下降；隨著MDA濃度的增大，籽瓜種仁蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸殘基被氧化修飾形成聚集體，水分子進入球蛋白內(nèi)部，使持水性得到提高。故籽瓜種仁蛋白質(zhì)在氧化后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而適度氧化有利于提高蛋白質(zhì)的持水性，為其生產(chǎn)加工及儲藏方面提供理論支撐。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 6 Effects of MDA oxidation at different concentrations on water-holding capacity of seeds-watermelon seed protein

2.9 持油性

由圖7可知，籽瓜種仁蛋白質(zhì)持油性隨MDA氧化程度的增加先上升后下降，在MDA濃度為0.10 mmol/L時達最大。Wu等[7]研究發(fā)現(xiàn)MDA可與大豆分離蛋白內(nèi)部氨基酸殘基接觸、反應(yīng)，暴露疏水基團。因而，不同濃度MDA氧化使得籽瓜種仁蛋白質(zhì)對油脂的吸附能力增加，但當MDA濃度較高時，籽瓜種仁蛋白質(zhì)在MDA的作用下共價交聯(lián)度增加，與油脂結(jié)合能力下降，導致持油性略微降低。故MDA氧化對籽瓜種仁蛋白質(zhì)的持油性有一定的促進作用，可提高產(chǎn)品的風味品質(zhì)。

2.10 凝膠特性的分析

由表3可知，籽瓜種仁蛋白質(zhì)凝膠的硬度、咀嚼性隨MDA濃度增大而減小，彈性在MDA濃度為0.10 mmol/L最好，恢復性變化不明顯。這可能是籽瓜種仁蛋白質(zhì)在加熱條件下發(fā)生變性，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開并發(fā)生分子間交聯(lián)，進而聚集形成凝膠[19]。因此，MDA氧化可在一定程度上破壞籽瓜種仁蛋白質(zhì)凝膠特性的形成，進而影響其生產(chǎn)應(yīng)用。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 7 Effects of MDA oxidation at different concentrations on oil-holding capacity of seeds-watermelon seed protein

表3 不同濃度MDA氧化對籽瓜種仁蛋白質(zhì)凝膠特性的影響?

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

隨著MDA濃度的升高，氧化程度加劇，籽瓜種仁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由無序變?yōu)橛行?，出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象；MDA氧化在一定程度上可提高籽瓜種仁蛋白質(zhì)的持水性及持油性，而其凝膠特性逐漸被破壞，因此，不同濃度梯度MDA對籽瓜種仁蛋白質(zhì)的凝膠特性會產(chǎn)生負面影響，進而影響其在凝膠加工過程中的應(yīng)用。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)較為復雜，代謝副產(chǎn)物較多，MDA為主要次生產(chǎn)物之一，脂質(zhì)過氧化對籽瓜種仁蛋白質(zhì)的影響機理有待進一步探討。