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        HPLC同時(shí)測(cè)定花果茶中3種成分的含量

        2019-12-19 02:18:58穆慶麗崔小敏陳志永蒙麥俠
        食品與藥品 2019年6期
        關(guān)鍵詞:項(xiàng)下兒茶素綠原

        陳 娟,穆慶麗,孟 雪,崔小敏,陳志永,蒙麥俠,郭 冬

        (陜西省中醫(yī)藥研究院,陜西 西安 710003)

        花果茶由金銀花、青果、胖大海、麥冬、綠茶、薄荷六味中藥組成,為陜西省中醫(yī)藥研究院自制保健產(chǎn)品,具有清熱利咽,疏散風(fēng)熱功效?,F(xiàn)代研究表明,金銀花具有解熱、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血等藥理作用,其中綠原酸是金銀花中的主要功效成分[1-3]。綠茶中含有大量的兒茶素、表兒茶素,都屬于多酚類物質(zhì),具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、改善糖尿病和神經(jīng)退行性病變、調(diào)節(jié)免疫功能等生物活性[4-7]。本實(shí)驗(yàn)以自制的花果茶為研究對(duì)象,建立了同時(shí)測(cè)定綠原酸、兒茶素和表兒茶素含量的方法,為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器

        Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent,美國(guó)),電子分析天平(北京賽多利斯,型號(hào)BP125D,d=0.01 mg;BP61,d=0.1 mg);KH-300D型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng))。

        1.2 對(duì)照品與試劑

        對(duì)照品綠原酸(批號(hào):110753-201817),兒茶素(批號(hào):110877-201604),表兒茶素(批號(hào):110878-201703)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;花果茶(規(guī)格:2.5 g/袋;批號(hào)分別為20180401,20180402,20180403)由本單位自制;甲醇、乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

        色譜柱為Welchrom C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);甲醇(A)-乙腈(B)-0.1 %磷酸水溶液(C)為流動(dòng)相,梯度洗脫,洗脫程序見表1,流速為1.0 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,柱溫:30℃,綠原酸、兒茶素、表兒茶素分離度均不得低于1.5,理論塔板數(shù)均不低于4000。

        表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取綠原酸、兒茶素和表兒茶素對(duì)照品適量,加入50 %甲醇溶液制備質(zhì)量濃度分別為0.047,0.25和0.1213 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

        2.2.2 供試品溶液制備 取本品樣品約0.1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別精密加入50 %甲醇50 ml,密塞,稱定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用50 %甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜,即得。

        2.2.3 陰性樣品溶液制備 按處方工藝制備缺金銀花、青果和綠茶的陰性樣品,按2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

        2.2.4 測(cè)定法 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,即得。

        2.3 專屬性試驗(yàn)

        分別吸取混合對(duì)照品、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μl,注入液相色譜儀,進(jìn)樣分析。結(jié)果表明,陰性樣品在對(duì)照品色譜圖主峰位置,無對(duì)應(yīng)色譜峰出現(xiàn),表明處方中其余組分對(duì)結(jié)果無影響。色譜圖見圖1。

        圖1 混合對(duì)照品(A);供試品(B);陰性對(duì)照(C)的高效液相色譜圖

        2.4 線性關(guān)系考察

        精密吸取2.2.1項(xiàng)下綠原酸、兒茶素和表兒茶素混合對(duì)照品溶液2,4,8,12,16,20 μl,在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析,記錄色譜圖,測(cè)定峰面積,以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表2。結(jié)果表明綠原酸、兒茶素、表兒茶素分別在0.0940~0.9400 mg,0.5000~5.0000 mg,0.2426~2.4260 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        表2 3種指標(biāo)性成分的回歸方程和線性范圍

        2.5 檢測(cè)限和定量限考察

        取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,逐步稀釋,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。分別以信噪比(S/N)為3和10時(shí)的對(duì)照品濃度為檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ)。結(jié)果,綠原酸、兒茶素、表兒茶素的LOQ分別為0.0078,0.0165,0.0066 μg,LOD分別為0.0024,0.0050,0.0020 μg。

        2.6 精密度試驗(yàn)和中間精密度試驗(yàn)

        精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μl,在2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。結(jié)果,綠原酸、兒茶素和表兒茶素峰面積的RSD分別為0.10 %,0.18 %,0.22 %,結(jié)果表明方法精密度良好。

        更換液相色譜儀為島津2010A-HT 型高效液相色譜儀(日本島津公司)和色譜柱Kromasil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),方法同精密度項(xiàng)下。結(jié)果,綠原酸、兒茶素和表兒茶素峰面積的RSD分別為0.71 %,0.59 %,0.76 %,結(jié)果表明方法中間精密度良好。

        2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

        精密稱取同一批花果茶(批號(hào)20180401) 6份,按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄峰面積。結(jié)果綠原酸平均含量為19.85 mg/g,RSD為0.18 %;兒茶素平均含量為29.09 mg/g,RSD為0.16 %;表兒茶素平均含量為14.1175 mg/g,RSD為0.41 %;結(jié)果表明,含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

        2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取同一供試品溶液,室溫下分別放置0,2,4,6,8,10,12 h,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。結(jié)果,綠原酸、兒茶素和表兒茶素峰面積的RSD分別為0.19 %,0.65 %,0.93 %,結(jié)果表明供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.9 加樣回收試驗(yàn)

        精密稱取已知各成分含量的樣品0.05 g(批號(hào)20180401),共稱取6 份,置具塞三角瓶中,分別精密加入綠原酸對(duì)照品溶液1 ml(濃度:1.0070 mg/ml),兒茶素對(duì)照品溶液1 ml(濃度:1.4860 mg/ml),表兒茶素對(duì)照品溶液1 ml(濃度:0.7295 mg/ml)。按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果測(cè)得綠原酸平均回收率為99.93 %,RSD為1.11 %;兒茶素平均回收率為100.19 %,RSD為1.29 %;表兒茶素平均回收率為100.26 %,RSD為1.74 %;表明該方法準(zhǔn)確性良好。結(jié)果見表3。

        表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

        2.10 耐用性試驗(yàn)

        取2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)色譜條件,分別調(diào)整波長(zhǎng)、流速、柱溫,同法測(cè)定,考察綠原酸、兒茶素和表兒茶素含量變化。測(cè)定結(jié)果為綠原酸平均含量為19.7442 mg/g,RSD為0.83 %;兒茶素平均含量為29.5973 mg/g,RSD為0.66 %;表兒茶素平均含量為14.6942 mg/g,RSD為0.94 %;結(jié)果表明該方法耐用性好。

        2.11 樣品含量測(cè)定

        分別取3批不同樣品各約0.1 g,精密稱定,按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄峰面積,計(jì)算樣品中綠原酸、兒茶素和表兒茶素含量,結(jié)果見表4。

        表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

        3 討論

        3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

        對(duì)3種指標(biāo)性成分在200~400 nm的紫外吸收全掃描,兒茶素和表兒茶素的最大吸收波長(zhǎng)均為280 nm,綠原酸在220,280,327 nm處均有較好的吸收,綜合考慮各成分在樣品中的最大吸收波長(zhǎng),故以280 nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

        3.2 流動(dòng)相的選擇

        本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1 %磷酸水、乙腈-0.1 %磷酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng),結(jié)果甲醇-0.1 %磷酸水和乙腈-0.1 %磷酸水的分離效果各有優(yōu)勢(shì),但均不能將綠原酸、兒茶素和表兒茶素同時(shí)完全分離,最終采用甲醇-乙腈-0.1 %磷酸水三相流動(dòng)相體系可將三者同時(shí)實(shí)現(xiàn)基線分離,達(dá)到定量測(cè)定的要求,且陰性樣品無干擾。

        3.3 兒茶素和表兒茶素的HPLC含量測(cè)定

        本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金銀花中含有大量的兒茶素和少量的表兒茶素。青果和綠茶中也含有兒茶素和表兒茶素,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8-9]。故本實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照品制備是去掉金銀花、青果和綠茶。

        綜上所述,本研究建立了同時(shí)測(cè)定花果茶中3種指標(biāo)性成分的方法,該方法操作簡(jiǎn)單,易于實(shí)施,準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好,能夠?yàn)榛ü璧馁|(zhì)量控制提供參考。

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