陳 娟，穆慶麗，孟 雪，崔小敏，陳志永，蒙麥俠，郭 冬

（陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

花果茶由金銀花、青果、胖大海、麥冬、綠茶、薄荷六味中藥組成，為陜西省中醫(yī)藥研究院自制保健產(chǎn)品，具有清熱利咽，疏散風(fēng)熱功效?，F(xiàn)代研究表明，金銀花具有解熱、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血等藥理作用，其中綠原酸是金銀花中的主要功效成分[1-3]。綠茶中含有大量的兒茶素、表兒茶素，都屬于多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、改善糖尿病和神經(jīng)退行性病變、調(diào)節(jié)免疫功能等生物活性[4-7]。本實(shí)驗(yàn)以自制的花果茶為研究對(duì)象，建立了同時(shí)測(cè)定綠原酸、兒茶素和表兒茶素含量的方法，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（Agilent，美國(guó)），電子分析天平（北京賽多利斯，型號(hào)BP125D，d=0.01 mg；BP61，d=0.1 mg）；KH-300D型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)）。

1.2 對(duì)照品與試劑

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)：110753-201817），兒茶素（批號(hào)：110877-201604），表兒茶素（批號(hào)：110878-201703）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；花果茶（規(guī)格：2.5 g/袋；批號(hào)分別為20180401，20180402，20180403）由本單位自制；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇（A）-乙腈（B）-0.1 %磷酸水溶液（C）為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫：30℃，綠原酸、兒茶素、表兒茶素分離度均不得低于1.5，理論塔板數(shù)均不低于4000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取綠原酸、兒茶素和表兒茶素對(duì)照品適量，加入50 %甲醇溶液制備質(zhì)量濃度分別為0.047，0.25和0.1213 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品樣品約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入50 %甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 按處方工藝制備缺金銀花、青果和綠茶的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 測(cè)定法 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別吸取混合對(duì)照品、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，陰性樣品在對(duì)照品色譜圖主峰位置，無對(duì)應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，表明處方中其余組分對(duì)結(jié)果無影響。色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）；供試品（B）；陰性對(duì)照（C）的高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.1項(xiàng)下綠原酸、兒茶素和表兒茶素混合對(duì)照品溶液2，4，8，12，16，20 μl，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。結(jié)果表明綠原酸、兒茶素、表兒茶素分別在0.0940～0.9400 mg，0.5000～5.0000 mg，0.2426～2.4260 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 3種指標(biāo)性成分的回歸方程和線性范圍

2.5 檢測(cè)限和定量限考察

取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，逐步稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。分別以信噪比（S/N）為3和10時(shí)的對(duì)照品濃度為檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果，綠原酸、兒茶素、表兒茶素的LOQ分別為0.0078，0.0165，0.0066 μg，LOD分別為0.0024，0.0050，0.0020 μg。

2.6 精密度試驗(yàn)和中間精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μl，在2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、兒茶素和表兒茶素峰面積的RSD分別為0.10 %，0.18 %，0.22 %，結(jié)果表明方法精密度良好。

更換液相色譜儀為島津2010A-HT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）和色譜柱Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），方法同精密度項(xiàng)下。結(jié)果，綠原酸、兒茶素和表兒茶素峰面積的RSD分別為0.71 %，0.59 %，0.76 %，結(jié)果表明方法中間精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批花果茶（批號(hào)20180401） 6份，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸平均含量為19.85 mg/g，RSD為0.18 %；兒茶素平均含量為29.09 mg/g，RSD為0.16 %；表兒茶素平均含量為14.1175 mg/g，RSD為0.41 %；結(jié)果表明，含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫下分別放置0，2，4，6，8，10，12 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、兒茶素和表兒茶素峰面積的RSD分別為0.19 %，0.65 %，0.93 %，結(jié)果表明供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知各成分含量的樣品0.05 g（批號(hào)20180401），共稱取6 份，置具塞三角瓶中，分別精密加入綠原酸對(duì)照品溶液1 ml（濃度：1.0070 mg/ml），兒茶素對(duì)照品溶液1 ml（濃度：1.4860 mg/ml），表兒茶素對(duì)照品溶液1 ml（濃度：0.7295 mg/ml）。按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果測(cè)得綠原酸平均回收率為99.93 %，RSD為1.11 %；兒茶素平均回收率為100.19 %，RSD為1.29 %；表兒茶素平均回收率為100.26 %，RSD為1.74 %；表明該方法準(zhǔn)確性良好。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.10 耐用性試驗(yàn)

取2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件，分別調(diào)整波長(zhǎng)、流速、柱溫，同法測(cè)定，考察綠原酸、兒茶素和表兒茶素含量變化。測(cè)定結(jié)果為綠原酸平均含量為19.7442 mg/g，RSD為0.83 %；兒茶素平均含量為29.5973 mg/g，RSD為0.66 %；表兒茶素平均含量為14.6942 mg/g，RSD為0.94 %；結(jié)果表明該方法耐用性好。

2.11 樣品含量測(cè)定

分別取3批不同樣品各約0.1 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算樣品中綠原酸、兒茶素和表兒茶素含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)3種指標(biāo)性成分在200～400 nm的紫外吸收全掃描，兒茶素和表兒茶素的最大吸收波長(zhǎng)均為280 nm，綠原酸在220，280，327 nm處均有較好的吸收，綜合考慮各成分在樣品中的最大吸收波長(zhǎng)，故以280 nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1 %磷酸水、乙腈-0.1 %磷酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果甲醇-0.1 %磷酸水和乙腈-0.1 %磷酸水的分離效果各有優(yōu)勢(shì)，但均不能將綠原酸、兒茶素和表兒茶素同時(shí)完全分離，最終采用甲醇-乙腈-0.1 %磷酸水三相流動(dòng)相體系可將三者同時(shí)實(shí)現(xiàn)基線分離，達(dá)到定量測(cè)定的要求，且陰性樣品無干擾。

3.3 兒茶素和表兒茶素的HPLC含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金銀花中含有大量的兒茶素和少量的表兒茶素。青果和綠茶中也含有兒茶素和表兒茶素，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8-9]。故本實(shí)驗(yàn)中的陰性對(duì)照品制備是去掉金銀花、青果和綠茶。

綜上所述，本研究建立了同時(shí)測(cè)定花果茶中3種指標(biāo)性成分的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)施，準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，能夠?yàn)榛ü璧馁|(zhì)量控制提供參考。