戚 敏，王 芳，逯海燕，劉 琳，劉愛(ài)明，徐玲玲，陳 凱，賈慶文，王本偉

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 新藥評(píng)價(jià)中心，山東 濟(jì)南 250101）

葉酸是一種水溶性維生素，其母體化合物是由喋啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸3種成分結(jié)合而成的。葉酸在人體內(nèi)主要參與嘌呤和嘧啶核苷酸的合成和轉(zhuǎn)化，參與構(gòu)成含鐵的血紅蛋白，參與蛋白質(zhì)的代謝等，是細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)[1-2]，臨床可用于預(yù)防神經(jīng)管畸形，還可用于治療慢性萎縮性胃炎、抑制支氣管鱗狀轉(zhuǎn)化及防治高同型半胱氨酸血癥引起的冠狀動(dòng)脈硬化癥、心肌損傷與心肌梗塞等[3-4]。研究表明葉酸還能抑制腫瘤細(xì)胞中癌基因的表達(dá)，從而阻斷惡性腫瘤的進(jìn)展[5]，但有研究認(rèn)為過(guò)量攝入葉酸可能會(huì)增加發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[6-8]，因此準(zhǔn)確定量血中葉酸含量的尤為重要。目前葉酸在機(jī)體內(nèi)的檢測(cè)主要有微生物測(cè)定法[9]、放射免疫測(cè)定法、色譜分析法[10]等，這些方法在專(zhuān)屬性、靈敏度等方面都存在一定的局限性，且樣品用量比較大，處理也較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究基于高效液相色譜和三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用（HPLC-MS/MS）建立了一種靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析速度快的新型葉酸檢測(cè)方法，并用于藥動(dòng)學(xué)研究，為其臨床用藥提供有益的參考。

1 儀器、試劑與動(dòng)物

1.1 儀器

Agilent 1260-6430液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（LCMS/MS，安捷倫），包括G1379B型脫氣機(jī)，G1312B型二元輸液泵，G1367E型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1330B型控溫模塊，G1316A型柱溫箱，6430 MS/MS系統(tǒng)及Mass Hunter數(shù)據(jù)采集軟件；XL16K-T臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器公司）；Advantage A10 Milli-Q超純水機(jī)[默克化工技術(shù)（上海）公司]；Vortex Genius 3渦旋儀（廣州儀科實(shí)驗(yàn)技術(shù)公司）。

1.2 試劑

葉酸（批號(hào)：100074-201214，純度89.7 %），格列本脲（批號(hào)：100135-201105，內(nèi)標(biāo)，純度99.5 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈（批號(hào)：154451，色譜純，F(xiàn)isher scientific）；甲酸（批號(hào)：BCBM5443V，色譜純，Sigma-Aldrich）；二甲亞砜（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；超純水。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠24只，體重180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]，在溫度25 ℃、濕度60 %±5 %條件下適應(yīng)1周。隨機(jī)分成3組，每組8只，雌雄各半，灌胃給予葉酸溶液，給藥劑量分別為0.8，2.4，8 mg/kg體重。給藥前12 h禁食，自由飲水。分別于給藥前，給藥結(jié)束0.5，1，2，4，6，8，24 h頸靜脈取血0.2 ml，置入預(yù)涂肝素鈉的離心管，4℃、4000 r/min離心10 min，取上層血漿，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱為T(mén)hermo Accucore C18柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相為0.1 %甲酸-水（A）與乙腈（B），洗脫梯度：0～0.5 min，5 % B；0.5～2.2 min，5 %→95 %B；2.2～3.2 min，95 %B；3.21～6 min，5 %B。樣品檢測(cè)時(shí)間：6 min；流速：0.4 ml/min；進(jìn)樣量：5 μl；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子化方式：電噴霧-正離子；干燥氣：N2；干燥氣流速10 L/min，干燥氣壓力40 psi，干燥氣溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓4000 V。監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。葉酸母離子及子離子為m/z442.2→295.1，碎片電壓100 V，碰撞能量10 eV；格列本脲母離子及子離子為m/z494.2/369.0，碎片電壓130 V，碰撞能量9 eV。

2.2 溶液配制

精密稱(chēng)取葉酸10 mg，置入10 ml量瓶，加二甲亞砜5 ml超聲溶解，乙腈定容至刻度，配制濃度為1.0 mg/ml的儲(chǔ)備液 ，加乙腈稀釋?zhuān)謩e配制不同濃度的葉酸溶液。精密稱(chēng)取格列苯脲10 mg，置入10 ml量瓶，乙腈溶解并定容至刻度，配制濃度為1.0 mg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.3 樣本處理方法

取血漿樣品30 μl，置入1.5 ml離心管，加入乙腈（含內(nèi)標(biāo)50 ng/ml）150 μl，渦旋混勻1 min，加超純水100 μl，渦旋混勻1 min，12 000 r/min 4 ℃，離心5 min，取上清進(jìn)樣檢測(cè)。

2.4 專(zhuān)屬性

取空白血漿30 μl，按2.3項(xiàng)方法操作，得空白質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖1A）；取1000 ng/ml的葉酸溶液10 μl，加空白血漿90 μl，渦旋后取30 μl，按2.3項(xiàng)方法操作，得分析物質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖1B）；取給藥后2 h的血漿樣品30 μl，按2.3項(xiàng)方法操作，得血漿樣品質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖1C）。葉酸和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.58，3.63 min，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物的準(zhǔn)確定量。

圖1 葉酸和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜圖

2.5 殘留效應(yīng)

在進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度最高點(diǎn)后進(jìn)樣空白樣品，評(píng)價(jià)殘留效應(yīng)，結(jié)果顯示葉酸的殘留量小于定量下限的10 %，說(shuō)明殘留不影響葉酸的準(zhǔn)確定量。

2.6 線性和定量下限

分別配制10，25，50，100，250，500，1000 ng/ml的血漿樣本溶液，按2.3項(xiàng)方法操作處理。以葉酸的濃度為橫坐標(biāo)（X），葉酸與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重為1/X2）進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=0.1272（±0.0050）X+0.0056（±0.0021），r=0.9971，表明葉酸在10～1000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取濃度為10 ng/ml的血漿樣本，按2.3項(xiàng)方法操作處理，進(jìn)樣檢測(cè)，平行測(cè)定6個(gè)樣本。結(jié)果準(zhǔn)確度為89.1 %，精密度為6.0 %。均符合生物樣本的檢測(cè)要求。

2.7 準(zhǔn)確度和精密度

分別配制定量下限（10 ng/ml）、低（20 ng/ml）、中（80 ng/ml）、高（800 ng/ml）4個(gè)濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液，按2.3項(xiàng)方法操作，每一濃度5個(gè)平行樣本，以標(biāo)準(zhǔn)曲線算得葉酸的濃度，并計(jì)算其批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度。連續(xù)處理3個(gè)分析批，計(jì)算葉酸的批間準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 葉酸的批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度與精密度（n=5）

2.8 回收率和基質(zhì)效應(yīng)

分別配制低（20 ng/ml）、中（80 ng/ml）、高（800 ng/ml）3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度6個(gè)平行樣本，按2.3項(xiàng)方法操作，得到的峰面積為set1。分別配制低（20 ng/ml）、中（80 ng/ml）、高（800 ng/ml）3個(gè)濃度的血漿樣本溶液，每一濃度6個(gè)平行樣本，按2.3項(xiàng)方法操作，得到的峰面積為set2。分別取低（20 ng/ml）、中（80 ng/ml）、高（800 ng/ml）3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液30 μl，加入提取后的空白血漿溶液150 μl，再加入100 μl水，渦旋混勻，每一濃度6個(gè)平行樣本，進(jìn)樣檢測(cè)，峰面積為set3。以set3/set1計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)；以set2/set3計(jì)算提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 葉酸和內(nèi)標(biāo)的回收率和基質(zhì)效應(yīng)（，n=6）

表2 葉酸和內(nèi)標(biāo)的回收率和基質(zhì)效應(yīng)（，n=6）

化合物 理論濃度/ng·ml-1回收率/%基質(zhì)效應(yīng)/%葉酸 20 80.0±4.1 102.9±4.4 80 95.4±4.4 103.0±5.6 800 93.0±4.7 104.8±5.1內(nèi)標(biāo) 50 95.6±5.1 93.5±3.2

2.9 穩(wěn)定性考察

分別配制低（10 ng/ml）、中（100 ng/ml）、高（800 ng/ml）3個(gè)濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液，每一濃度6個(gè)平行樣本，分別考察3個(gè)冷凍（-20 ℃）-解凍（室溫）周期穩(wěn)定性、室溫短期6 h穩(wěn)定性、長(zhǎng)期30 d穩(wěn)定性（-20 ℃）和樣品制備后在自動(dòng)進(jìn)樣器15 ℃放置24 h穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 葉酸的穩(wěn)定性（n=6）

2.10 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

大鼠血漿樣本從冰箱取出，室溫解凍，取30 μl，置入1.5 ml離心管，按2.3項(xiàng)方法操作，依隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣本的濃度。用DAS3.0軟件采用非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表4和圖2。

3 討論

3.1 空白血漿的選擇

由于葉酸是內(nèi)源性化合物，空白血漿可能會(huì)產(chǎn)生干擾，因此在方法學(xué)驗(yàn)證中對(duì)大鼠空白血漿進(jìn)行了篩選，最終選擇不干擾葉酸準(zhǔn)確定量（干擾較小）的空白血漿進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

表4 大鼠灌胃給予葉酸溶液后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（ ，n=8）

表4 大鼠灌胃給予葉酸溶液后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（ ，n=8）

參數(shù) 劑量/mg·kg-1 0.8 2.4 8 Cmax/ng·ml-1 157.4±69 259.9±126 335.0±98 Tmax/h 0.8±0.3 1.1±0.5 1.4±0.6 t1/2/h 5.4±1.2 5.1±1.2 4.4±0.9 AUC0-24 h/h·ng·ml-1 710.0±176 1092.1±567 2047.8±654 AUC0-∞/h·ng·ml-1 791.0±199 1156.0±563 2234.2±717 AUC0-24 h/AUC0-∞/% 89.8 94.5 91.7

圖2 大鼠灌胃給藥后血漿中平均藥物濃度-時(shí)間曲線

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究對(duì)不同的流動(dòng)相和色譜柱進(jìn)行了考察，最終選擇乙腈和0.1 %的甲酸-水做為流動(dòng)相，梯度洗脫；色譜柱選擇Thermo Accucore C18柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）；具有較好的分離度和色譜峰型，且血漿中內(nèi)源性化合物不會(huì)干擾分析物和內(nèi)標(biāo)的離子化。

葉酸和內(nèi)標(biāo)格列本脲的質(zhì)譜參數(shù)采用Agilent optimizer軟件自動(dòng)優(yōu)化，獲得的離子對(duì)、碎片電壓和碰撞能量均能滿(mǎn)足方法靈敏度要求。

3.3 血漿樣本處理方法的優(yōu)化

葉酸是水溶性維生素，極性相對(duì)較大，采用血漿加有機(jī)溶劑的蛋白沉淀方法進(jìn)行預(yù)處理，葉酸的回收率小于10 %，重現(xiàn)性較差。固相萃取方法雖能滿(mǎn)足方法學(xué)要求，但處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)，成本高。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)采用有機(jī)溶劑進(jìn)行蛋白沉淀后添加適量的純化水，葉酸的回收率達(dá)80 %。因此在本研究中樣本處理方法采用在蛋白沉淀后添加水的方式，既能保證方法的重現(xiàn)性，又可提高檢測(cè)效率。

3.4 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

由于大鼠血漿中存在葉酸，因此本研究選擇先扣除零點(diǎn)基線，再進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)。大鼠灌胃給藥后葉酸在1 h左右達(dá)到最大濃度，且隨著給藥劑量的增加達(dá)峰時(shí)間有延后的趨勢(shì)。Cmax和AUC0-∞在低、中、高3個(gè)劑量下的比值分別為1:1.7:2.1和1:1.5:2.9，葉酸在大鼠體內(nèi)的最大血藥濃度和暴露量隨劑量的增加而增大，但和劑量不成線性相關(guān)。低、中、高3個(gè)劑量下AUC0-24h和AUC0-∞的比值均在90 %左右，說(shuō)明采樣點(diǎn)設(shè)計(jì)較合理，采集24 h內(nèi)的血漿樣品能滿(mǎn)足對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的評(píng)估。

本研究基于HPLC-MS/MS技術(shù)建立了大鼠血漿中葉酸的分離分析方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，成功應(yīng)用于SD大鼠灌胃給予葉酸溶液后血漿中葉酸的濃度檢測(cè)。此方法血漿用量少，靈敏度高，重現(xiàn)性好。