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        響應(yīng)面法優(yōu)化通經(jīng)草總黃酮提取工藝

        2019-12-19 02:18:50桑志國(guó)呂元琦
        食品與藥品 2019年6期
        關(guān)鍵詞:黃酮工藝優(yōu)化

        袁 哲,桑志國(guó),孫 姍,呂元琦*

        (1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250200;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所,山東 濟(jì)南 250062;3.國(guó)家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南250062;4.德州學(xué)院分析測(cè)試中心,山東 德州 253023)

        通經(jīng)草又名銅絲草、金絲草等,是中國(guó)蕨科粉背蕨屬銀粉背蕨[Aleuri-topteris argentea(Gmel.)Fée]的干燥全草[1],具有活血調(diào)經(jīng)、止咳、利濕、解毒消腫等功效[2],在我國(guó)藏族、蒙古族和朝鮮族等少數(shù)民族地區(qū)應(yīng)用較普遍。藥理研究證實(shí)通經(jīng)草具有抗炎功效,且其藥理作用主要與黃酮類(lèi)組分有關(guān)[3]。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化通經(jīng)草總黃酮的超聲提取工藝,以期為該藥的研究開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        UV2800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科);SHK-IIIS循環(huán)水式多用真空泵(鄭州科泰);KQ-250B型超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司)。

        1.2 材料與試劑

        蘆丁對(duì)照品(國(guó)藥集團(tuán));亞硝酸鈉(純度>99.0 %,天津博迪);硝酸鋁[純度>99.0 %,阿拉丁試劑(上海)有限公司];氫氧化鈉(分析純,西隴化工);無(wú)水乙醇(分析純,西隴化工)。

        2 方法

        2.1 通經(jīng)草總黃酮的提取工藝

        將通經(jīng)草在陽(yáng)光下曬干,60 ℃鼓風(fēng)干燥6 h,粉碎,過(guò)80目篩。準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品1.000 g,按一定料液比,加入一定濃度的乙醇,超聲提取一定時(shí)間,濾過(guò),加一定濃度乙醇定容至50 ml,得黃酮粗提物備用。

        2.2 測(cè)定方法

        2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱(chēng)取5.0 mg蘆丁對(duì)照品,置入50 ml量瓶,加60 %乙醇溶解,定容,得0.1 mg/ml對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0 ml,置入9支比色管,每管加入5 % NaNO2溶液0.4 ml,搖勻,靜置6 min;加入0.4 ml 10 %硝酸鋁,搖勻,靜置6 min;加入4 % NaOH 溶液4 ml,搖勻;加入60 %乙醇定容至10 ml,搖勻,靜置15 min[3],使用紫外分光光度計(jì)在510 nm 處測(cè)量其吸光度,以吸光度(A)為縱坐標(biāo),濃度(C,mg/ml)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        2.2.2 通經(jīng)草總黃酮含量測(cè)定 取樣品溶液5 ml,加入57 %乙醇溶液定容至10 ml,即稀釋2倍。取稀釋液1 ml,按2.2.1項(xiàng)方法測(cè)定樣品溶液在510 nm波長(zhǎng)處吸光值。依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品溶液濃度C(mg/ml),再由以下公式計(jì)算出通經(jīng)草黃酮提取量。

        通經(jīng)草總黃酮收率(%)=提取液中通經(jīng)草總黃酮含量(mg)/通經(jīng)草藥材重量(mg)×100 %

        2.3 單因素考察

        2.3.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮收率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取通經(jīng)草細(xì)粉1.0 g,固定料液比為30:1,超聲提取75 min,考察乙醇濃度(30 %,40 %,50 %,60 %,70 %)對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率的影響。

        2.3.2 料液比對(duì)總黃酮收率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取通經(jīng)草細(xì)粉1.0 g,加入一定量60 %乙醇超聲提取75 min,考察料液比(15:1,20:1,25:1,30:1,35:1)對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率的影響。

        2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮收率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取通經(jīng)草細(xì)粉1.0 g,按30:1料液比加入60 %乙醇,考察超聲提取時(shí)間(30,45,60,75,90 min)對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率的影響。

        2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化通經(jīng)草總黃酮提取工藝

        根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選用乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間3個(gè)影響因素為自變量,以通經(jīng)草總黃酮收率為響應(yīng)值,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)3因素3水平三元二次響應(yīng)面分析方法,進(jìn)行提取條件的優(yōu)化,采用Design-Expert進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

        表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

        3 結(jié)果與分析

        3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

        按2.2.1項(xiàng)方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為y=41.596x+0.0035,R2=0.9998,表明在0.01~0.09 mg/ml范圍內(nèi),吸光度與濃度的線性關(guān)系良好。

        3.2 單因素試驗(yàn)

        3.2.1 乙醇濃度對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖1。

        圖1 乙醇濃度對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率的影響

        由圖1可見(jiàn),當(dāng)乙醇濃度在30 %~60 %之間時(shí),通經(jīng)草總黃酮的提取量隨乙醇濃度的增加緩慢增大,當(dāng)乙醇濃度達(dá)60 %時(shí),黃酮提取量迅速達(dá)到最高,之后隨著乙醇濃度提高,黃酮提取量又迅速下降。這主要是由于提取劑隨著乙醇濃度的變化其極性發(fā)生變化,只有在適當(dāng)極性下才能保證提取劑中黃酮的溶解量達(dá)最大[4]。因此,乙醇濃度為60 %時(shí)利于通經(jīng)草總黃酮的提取。

        3.2.2 料液比對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖2。

        圖2 料液比對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率的影響

        由圖2可見(jiàn),隨著液料比的增加,黃酮的提取量先增大后減小,當(dāng)液料比為30:1時(shí),黃酮提取量最大。推測(cè)當(dāng)液料較小時(shí),隨著液料比的增加,通經(jīng)草粉末與提取液的接觸面增加,黃酮類(lèi)物質(zhì)向溶劑溶出的阻力減小,使得提取液中溶解的黃酮含量增加[4]。當(dāng)液料比達(dá)30:1后繼續(xù)增大,可能會(huì)因?yàn)檫^(guò)多的溶劑對(duì)超聲波產(chǎn)生一定的吸收,或因溶劑體積過(guò)大而影響傳質(zhì)過(guò)程,從而導(dǎo)致提取液中的黃酮類(lèi)物質(zhì)不增反降[5]。所以30:1的液料比較適宜。

        3.2.3 提超聲時(shí)間對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率的影響 結(jié)果見(jiàn)圖3。

        圖3 超聲時(shí)間對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率的影響

        由圖3可見(jiàn),隨超聲時(shí)間的增加,通經(jīng)草總黃酮收率呈先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)超聲提取時(shí)間為75 min時(shí),總黃酮收率達(dá)最大值。這是因?yàn)辄S酮類(lèi)物質(zhì)的充分溶出需要足夠的時(shí)間,但過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲作用可能使部分黃酮類(lèi)成分發(fā)生降解。因此,選擇提取時(shí)間75 min比較適宜。

        3.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果

        提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 通經(jīng)草總黃酮提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化方案及結(jié)果

        3.4 回歸方程和方差分析

        以通經(jīng)草總黃酮收率為響應(yīng)值的線性回歸方程為:Y=10.27+0.06A+0.34B+0.21C-0.51AB+0.097AC-0.49BC-1.27A2-0.058B2-1.05C2。模型分析結(jié)果表明:P<0.0001,回歸模型極顯著,失擬項(xiàng)P=0.1018(P>0.05),失擬項(xiàng)不顯著,對(duì)試驗(yàn)擬合性較好。R2=0.9961,R2Adj=0.9910,模型擬合程度較好。顯著性檢驗(yàn)表明,乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率影響顯著,影響主次順序?yàn)椋毫弦罕龋˙)>超聲時(shí)間(C)>乙醇濃度(A)。乙醇濃度和料液比交互項(xiàng)AB、料液比和超聲時(shí)間的交互項(xiàng)BC的P值小于0.001,表明乙醇濃度和料液比,料液比和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率有顯著影響?;貧w方程分析見(jiàn)表3。

        表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果

        3.5 等高線和響應(yīng)圖分析

        通過(guò)Design-Expert 8.0軟件對(duì)乙醇濃度(X1)、料液比(X2)、超聲時(shí)間(X3)各因子間的相互作用進(jìn)行分析,得到了圖4~圖6的響應(yīng)面和等高線圖。響應(yīng)面分析圖中,響應(yīng)面越陡峭,則該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著;相反則該因素影響不顯著。等高線圖中,可直接觀察到各影響因子交互作用強(qiáng)度,等高線接近于圓形,影響因子交互作用不強(qiáng);相反,等高線越接近于橢圓形,說(shuō)明兩個(gè)影響因子間的交互作用較強(qiáng)[5]。由圖4、圖6可見(jiàn)乙醇濃度(X1)與料液比(X2)、料液比(X2)與超聲時(shí)間(X3)的等高線接近于橢圓,說(shuō)明乙醇濃度(X1)與料液比(X2)、料液比(X2)與超聲時(shí)間(X3)有較強(qiáng)的交互作用。由圖5可見(jiàn)乙醇濃度(X1)與超聲時(shí)間(X3)等高線接近于圓形,說(shuō)明乙醇濃度(X1)與超聲時(shí)間(X3)交互作用較小。

        通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化,最終確定超聲提取通經(jīng)草總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度56.91 %,料液比33.76:1,超聲時(shí)間76.79 min,響應(yīng)分析預(yù)測(cè)通經(jīng)草總黃酮收率為10.51 %,結(jié)合實(shí)際操作考慮,將提取條件調(diào)整為:乙醇濃度57 %,料液比34:1,超聲時(shí)間77 min。

        圖4 乙醇濃度和料液比對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面和等高線分析圖

        圖5 乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面和等高線分析圖

        圖6 料液比和超聲時(shí)間對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面和等高線分析圖

        3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

        按優(yōu)化后工藝條件,進(jìn)行3次平行試驗(yàn),測(cè)得通經(jīng)草總黃酮的平均收率為10.19 %(RSD=0.19 %),與理論值相差僅為0.32 %,說(shuō)明響應(yīng)面法得到的最佳提取工藝有較強(qiáng)的可行性。該方法優(yōu)化的通經(jīng)草總黃酮的收率亦明顯高于單變量?jī)?yōu)化所得值(Y=9.59 %)。

        4 結(jié)論

        通過(guò)單因素試驗(yàn),考察了乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間對(duì)通經(jīng)草總黃酮收率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙醇濃度為60 %,料液比為30:1,超聲時(shí)間為75 min時(shí),分別達(dá)到單因素條件下通經(jīng)草總黃酮收率的最佳水平。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以通經(jīng)草總黃酮收率為指標(biāo),根據(jù)Box-Behnen中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間3個(gè)考察因素,設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析法,確定提取通經(jīng)草總黃酮的最佳工藝:乙醇體積為57 %、料液比為34:1、超聲時(shí)間77 min,通經(jīng)草總黃酮收率達(dá)10.19 %。與傳統(tǒng)提取工藝相比,提高了通經(jīng)草總黃酮收率,為通經(jīng)草的開(kāi)發(fā)及利用提供了理論依據(jù)。

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