陳歡，王斌，史學(xué)偉，鄭曉吉，郭孝敬，黃倩

(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000)

大量研究證明，人體胃腸道內(nèi)的乳酸菌重要種類及數(shù)量對人體健康有著極為重要的作用，一些益生乳酸菌可在人體的腸道內(nèi)吸附并且繁殖，從而形成了生理性防護屏障，間接起到了排斥、抑制有害菌的存活生長，調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境、穩(wěn)定健康的作用[1]。不僅如此，乳酸菌在食品領(lǐng)域也有其他菌種不可替代的作用，目前乳酸菌在乳制品、調(diào)味品等類型的食品中都得到了重要的應(yīng)用。例如，乳酸菌對于食醋的釀造是至關(guān)重要的微生物群體，在此過程中酒精與乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸會發(fā)生酯化反應(yīng)生成醋中的重要芳香呈味物質(zhì)乳酸乙酯，醋在釀造過程中若沒有乳酸菌或乳酸菌的量不足就會導(dǎo)致食醋的口感欠缺[2]。

奶酪是新疆哈薩克族最具特色的自制發(fā)酵食品之一，這種特色奶酪中蘊含著大量的乳酸菌資源，但是隨著這些年國內(nèi)工業(yè)化進程的飛速發(fā)展，人們對于市場上商業(yè)化的奶酪需求遠(yuǎn)大于這類傳統(tǒng)手工奶酪，又因乳酸菌對奶酪風(fēng)味有著十分重要的影響，這樣不僅會造成奶酪口味的單一，更會造成優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源的流失。所以，本研究對新疆部分地區(qū)的哈薩克族傳統(tǒng)奶酪中具有潛在益生特性的乳酸菌進行了篩選，期望可以對該地區(qū)的優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源及這類傳統(tǒng)奶酪起到一定的保護作用，并為益生菌食品的發(fā)展奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株來源：本試驗從新疆伊犁地區(qū)牧民自制哈薩克族傳統(tǒng)奶酪中分離篩選出8株乳酸菌。

主要試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、溶菌酶：北京酷來搏科技有限公司；細(xì)菌通用引物27F與1492r：上海捷瑞生物工程有限公司；瓊脂糖：生工生物工程(上海)有限公司；牛膽鹽：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基[3]

MRS固體培養(yǎng)基：牛肉膏 10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂 18.0 g、蒸餾水1000 mL。

MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏 10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、蒸餾水1000 mL。

1.3 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ無菌操作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；CX21 FS1光學(xué)顯微鏡 Olympus公司；X7型多功能酶標(biāo)儀 基因有限公司；SPX-240B生化培養(yǎng)箱 常州諾基儀器有限公司；5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf儀器公司；B2J0智能數(shù)顯恒溫油水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；BYY-BC電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株的耐酸能力測定[4]

用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基，pH值分別調(diào)為2，3.5，5，6.5，8，9.5，將純化的菌懸液以2%的接種量于不同pH值的200 mL MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h，將不同pH的菌液，用酶標(biāo)儀測定OD600 nm值，每組3個平行試驗,以分析酸度對乳酸菌生長狀況的影響。

1.4.2 菌株對膽鹽耐受性測定

將待測菌株活化2次，活化好的乳酸菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)24 h后，于3500 r/min離心20 min，收集菌體沉淀棄上清液，菌體用等體積的滅菌的生理鹽水洗滌3次，以相同的條件離心，再將菌體重懸于等體積的生理鹽水中即可[5]。

將上述種子液分別接種于含有膽鹽0.03%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的液體MRS培養(yǎng)基中混勻，37 ℃培養(yǎng)24 h后用菌落平板計數(shù)法計算活菌數(shù)，每組做3個平行試驗，計算公式如下：

式中：Nth為含有不同濃度膽鹽的MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)，CFU/mL；Noh為不含膽鹽的MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)，CFU/mL。

1.4.3 菌株對模擬胃液耐受性測定[6-8]

新鮮人工模擬胃液的配制：將胃蛋白酶溶于PBS緩沖液中使其終濃度為3 g/L，用HCl調(diào)節(jié)pH值為2.7，經(jīng)0.2 μL無菌濾膜過濾即為人工模擬胃液。

將試驗篩選的乳酸菌進行活化后，取30 mL乳酸菌培養(yǎng)物在4 ℃，3500 r/min下離心12 min，收集到的菌體用滅菌后的PBS緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 7.2，內(nèi)含80 g/L NaCl)以1∶9的比例稀釋。然后取0.2 mL懸浮液添加到2.0 mL模擬胃液中在37 ℃，250 r/min搖床培養(yǎng)，分別在1，2，3 h用酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)前后的OD600 nm值，計算菌株的存活率：

式中：ODth為菌株在人工模擬胃液1，2，3 h后的吸光度；ODoh為沒有放進人工模擬胃液中的初始值。

1.4.4 菌株降解亞硝酸鹽能力的測定

乳酸菌株降解亞硝酸鹽的能力根據(jù)文獻[9]和文獻[10]進行測定。

1.4.5 菌株的表面疏水性測定[11，12]

本試驗采用微生物粘附碳烴化合物法，以二甲苯萃取菌體的能力作為評價乳酸菌的疏水能力。取8 mL將經(jīng)過28 h在最適溫度下活化后的乳酸菌液在9000 r/min、4 ℃條件下離心8 min，棄上清液留沉淀，將沉淀用pH為6.8的PBS緩沖液洗滌2次后，再次在相同條件下離心，重新懸浮收集菌體，用PBS緩沖液調(diào)整菌液的濃度，用酶標(biāo)儀測定OD600 nm的吸光值在0.6～0.8之間，取4 mL的菌液與800 μL的二甲苯混合，振蕩1 min，室溫靜置20 min后發(fā)生相分離，提取水相并測定OD600 nm處的吸光值，以計算菌株的疏水性：

式中：A0與At是加二甲苯前后在OD600 nm處的吸光度。

1.4.6 菌株的抑菌性測定[13，14]

選用牛津杯法對菌株的抑菌特性進行測定，將篩出的乳酸菌和指示菌經(jīng)過2次活化后進行平板計數(shù)，調(diào)整菌液濃度為106CFU/mL。吸取指示菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)8 mL分別于800 mL的MRS培養(yǎng)基中混勻，將滅菌的牛津杯放置在無菌的平板上，使杯底緊貼于平皿底部，將混有指示菌的MRS培養(yǎng)基倒平板，等平板凝固后拔出牛津杯，在孔中加入100 μL的乳酸菌種子液，在最適溫度條件下培養(yǎng)24 h后，測定抑菌圈直徑大小。

1.4.7 16S rDNA測序

1.4.7.1 乳酸菌DNA的提取及PCR擴增

乳酸菌基因組DNA提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書中的步驟進行提取，可用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。提取的基因組DNA進行PCR擴增，上游引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGTCAG-3')，下游引物(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')均為細(xì)菌16S rDNA的通用引物。PCR擴增條件及反應(yīng)體系參考文獻[15]和文獻[16]。

1.4.7.2 擴增產(chǎn)物測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立[17]

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，將產(chǎn)物(長度在1500 bp左右)送至公司進行單向測序，測得的序列在NCBI的Blast程序上進行同源性分析，從數(shù)據(jù)庫中獲得16S rDNA的序列同源性比對，比對結(jié)果使用Mega 6.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的耐酸能力

分離鑒定的8株乳酸菌于不同pH值環(huán)境下的生長狀況見圖1，OD600 nm處的吸光度代表該菌株對酸堿的耐受程度。

圖1 菌株在不同pH下的生長狀況Fig.1 Growth of strains at different pH values

由圖1可知8株乳酸菌在不同酸度下的生長狀況，酸度過高或過低都不利于菌株的生長。幾株乳酸菌的生長趨勢較相似，pH在2～6.5之間，菌株的吸光度不斷增加，說明乳酸菌在這個區(qū)間內(nèi)的菌落數(shù)隨酸度減小而不斷增加；pH在6.5～9.5之間時，乳酸菌的菌落數(shù)隨著酸度的減小而受到了抑制。菌株D-12、S-4、B-9這3株菌在不同pH條件下的吸光度相對較低，各pH梯度之間降幅也較大，且在pH為2的高酸環(huán)境下，3株乳酸菌的吸光度都小于0.2，說明菌株在高酸條件下的生長受到了抑制；菌株D-14、D-2、S-7、B-6、S-3在各個pH環(huán)境下吸光度相對較高，即有較高的生長活性，在pH為2的高酸環(huán)境下，這5株菌的吸光度均大于0.4；在pH為9.5的堿性環(huán)境下，這5株菌的吸光度均大于0.8，說明菌株D-14、D-2、S-7、B-6、S-3相對于D-12、S-4、B-9的耐酸堿能力強。

2.2 菌株對膽鹽的耐受性

將分離鑒定的8株乳酸菌分別接種到含有不同濃度膽鹽的MRS培養(yǎng)基中于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，菌株的存活率表示各菌株在不同濃度膽鹽環(huán)境中的耐受性，見圖2。

圖2 菌株在不同濃度膽鹽中的生長狀況 Fig.2 Growth of strains in different concentration of bile salts

由圖2可知，不同濃度的膽鹽對8株乳酸菌的存活率影響的差異較大，菌株隨著膽鹽濃度的增大受到的抑制隨之增加。當(dāng)培養(yǎng)基中膽鹽濃度為0.03%時，各菌株的存活率均大于55%，其中菌株D-14、S-7、B-6的存活率更是達到了75%以上；當(dāng)培養(yǎng)基中膽鹽濃度為0.1%時，各菌株存活率都明顯下降，菌株D-2、S-7、B-6、S-3的存活率均大于45%；當(dāng)培養(yǎng)基中膽鹽濃度為0.2%時，只有菌株S-7、S-3的存活率大于25%，而菌株D-12、S-4、B-9的耐受性較差，存活率均低于25%；當(dāng)培養(yǎng)基中膽鹽濃度為0.3%與0.4%時，8株菌的存活率迅速降低到5%以下，菌株S-4、B-9在這兩種環(huán)境下的存活率為0，菌株D-12在膽鹽濃度為0.3%的條件下具有一定存活率，但在膽鹽濃度為0.4%的條件下存活率下降到0，菌株D-14、S-3、S-7、B-6、D-2在這兩種環(huán)境下均有一定的存活率，但D-2在膽鹽濃度為0.4%時存活率幾乎接近0。所以，菌株D-14、S-3、S-7、B-6這4株菌對膽鹽的耐受性較強。

2.3 菌株對模擬人體胃液的耐受性

將經(jīng)過上述試驗的菌株置于模擬的人體胃液中，分別在1，2，3 h后測定菌株的存活率，見圖3。

圖3 菌株在模擬人體胃液下的生長狀況Fig.3 Growth of strains in simulated human gastric juice

由圖3可知，8株菌在胃液中的生長狀況因菌株各自的特異性與在胃腸道中停留時間的差異而不同，菌株D-14、D-2在3個時間段的存活率都比較高，存活率均達到了60%以上；菌株S-7在模擬胃液中培養(yǎng)2 h，存活率也均在50%以上，3 h的存活率下降到了40%左右；1 h菌株B-6與S-3存活率在65%以上，高于D-12、S-4、B-9在模擬胃液中40%～55%的存活率，3 h后菌株的存活率均有所下降，菌株D-12、S-4、B-9的存活率均下降到25%以下。所以，菌株D-14、D-2、S-7若較長時間處在模擬胃液環(huán)境下，相對于其他菌株對于人工胃液有較高的耐受性。

2.4 菌株降解亞硝酸鹽的能力

將經(jīng)上述試驗得到的益生菌株D-14、D-2、S-7、B-6、S-3接種到含有150 μg/mL NaNO2的MRS培養(yǎng)液中，放置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分析5株菌對亞硝酸鹽的降解能力，見圖4。

圖4 菌株降解亞硝酸能力比較Fig.4 Comparison of nitrite degradation ability of strains

由圖4可知，5株菌降解亞硝酸鹽的能力存在顯著性差異(P<0.05)。菌株D-14對亞硝酸鹽的降解率是78%左右，顯著高于菌株S-7、B-6、S-3，菌株B-6與其他4株菌存在顯著性差異(P<0.05)，對亞硝酸鹽的降解率為68%左右，顯著低于菌株D-14、D-2、S-7、S-3。菌株D-2與菌株S-3存在顯著性差異(P<0.05)，亞硝酸鹽降解率分別為73%與65%左右，除了菌株B-6其他菌株對亞硝酸鹽的降解率均在75%以上。

2.5 菌株的表面疏水性

將經(jīng)上述試驗得到的益生菌株D-14、D-2、S-7、B-6、S-3經(jīng)一定處理后的菌液與二甲苯混合，二甲苯與菌體的結(jié)合力來作為乳酸菌的疏水能力的標(biāo)準(zhǔn)，分析不同乳酸菌株之間表面疏水性差異，見圖5。

圖5 菌株表面疏水性比較Fig.5 Comparison of surface hydrophobicity of strains

由圖5可知，5株菌之間的表面疏水性存在顯著性差異(P<0.05)。菌株D-14與D-2表面疏水性較高，范圍在35%～40%之間，顯著高于菌株S-7、B-6與S-3。菌株B-6與S-3表面疏水性較低，菌株S-7表面疏水性為27%左右，顯著高于菌株B-6、S-3的表面疏水性。

2.6 菌株的抑菌性

將菌株D-14、D-2、S-7、S-3接種到含病原菌的MRS培養(yǎng)基中，分析這4株菌的抑菌效果，見表1。

表1 菌株抑菌效果比較Table 1 Comparison of antibacterial effect of strains

由表1可知，各菌株對兩種病原菌的抑制作用存在顯著性差異(P<0.05)。S-3對大腸桿菌有抑制作用，對金黃色葡萄球菌無抑制作用，是4株菌中抑制作用最小的；菌株D-14在含有大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基上均有較大的抑菌圈，菌株D-14的抑菌性在這4株菌中最好；菌株D-2與S-7對大腸桿菌的抑制作用不存在顯著性差異(P>0.05)，對金黃色葡萄球菌的抑制作用菌株D-2顯著高于菌株S-7。

2.7 菌株16S rDNA測序分析

分別提取D-14、D-2、S-7、S-3的基因組DNA后，進行PCR擴增，見圖6。擴增得到4株待測菌株的條帶清晰明亮，無明顯拖尾現(xiàn)象，4株菌的條帶大小均在1.5 kb附近，與理論值相符。

將4株乳酸菌的DNA擴增產(chǎn)物測序，測序結(jié)果登錄NCBI通過Blast對比分析，發(fā)現(xiàn)D-14與干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)的同源性達99%，D-2與格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)的同源性達100%，S-7與瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)的同源性達100%，S-3與乳酸明串球菌(Leuconostoclactis)的同源性在98%以上。

圖6 16S rDNA擴增結(jié)果Fig.6 Amplification result of 16S rDNA

圖7 基于4株菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic trees based on 16S rDNA sequences of four strains of bacteria

3 結(jié)論

乳酸菌是一類在自然界分布很廣泛的細(xì)菌，有著較為豐富的生物多樣性，它們不僅在理論上具有重要的學(xué)術(shù)價值，也是各領(lǐng)域研究(如：基因工程、遺傳、分子生物等)的優(yōu)良菌種[18，19]。本研究對從新疆伊犁地區(qū)采集的哈薩克族傳統(tǒng)奶酪中篩選出的8株乳酸菌進行了體外耐酸、耐膽鹽、模擬人體胃液、降解亞硝酸鹽、疏水性及抑菌試驗。結(jié)果表明，菌株D-14、D-2、S-7、B-6、S-3耐酸堿能力較好；菌株D-14、S-7、B-6、S-3對膽鹽的耐受性較好，當(dāng)膽鹽的濃度為0.3%與0.4%時，這4株菌在這兩種環(huán)境下均有一定的存活率，菌株D-2在膽鹽濃度為0.4%時的存活率幾乎接近于0；菌株D-14、D-2在3個時間段的存活率都比較高，存活率均達到了70%以上；菌株S-7在模擬胃液中培養(yǎng)1 h與2 h后，存活率也均在70%以上，3 h后的存活率下降到了50%左右；菌株D-14降解亞硝酸鹽的能力及疏水性最好，菌株D-14、D-2、S-7及S-3具有抑菌性。最終得到具有潛在益生性的菌株D-14、D-2、S-7及S-3，再對這4株益生乳酸菌進行16S rDNA測序，結(jié)果表明D-14為干酪乳桿菌，D-2為格氏乳球菌，S-7為瑞士乳桿菌，S-3為乳酸明串球菌。后期將對這4株潛在益生乳酸菌的產(chǎn)酶特性進行研究，將其作為益生功能性乳制品研發(fā)的潛在益生菌資源。