周夢瑩，唐露靜，黃檬檬，徐佳璐，魯鍇杰，朱欣，蔣明

（臺州學院生命科學學院，浙江臺州 318000）

大花無柱蘭（Amitostigma pinguiculum）隸屬于蘭科（Orchidaceae）無柱蘭屬，為浙江特有種，主要分布在溫州、金華、麗水和臺州等地，通常生長在海拔250～400 m的潮濕且有覆土的巖石上或溝邊草叢中，入國家Ⅱ級保護植物名錄[1-2]。大花無柱蘭為多年生草本植物，花型奇特、花色艷麗、姿態(tài)優(yōu)美，具有很高的觀賞價值，可用于盆栽、片植或點綴假山（見圖1）；大花無柱蘭的塊莖、全草均可入藥，具有活血化瘀和解毒消腫等功效[1]。近年來，由于山地開發(fā)、生境破壞和過度采挖等，大花無柱蘭的植株數(shù)量急劇減少。大花無柱蘭對生存環(huán)境的要求較高，繁殖能力較弱，根據(jù)筆者多年的野外觀察和調查，該植物在部分地區(qū)已絕跡。大花無柱蘭已列入《野生動植物瀕危物種國際貿易公約》，該物種亟待研究和保護[2]。

圖1 大花無柱蘭及其生境Fig.1 Amitostigma pinguiculum and its habitat

近年來，分子生物學技術發(fā)展迅速，分子標記技術日新月異。限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和相關序列擴增多態(tài)性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）等已廣泛應用于遺傳多樣性分析和種質資源鑒定等[3]。每種標記都有各自的優(yōu)缺點，其中SRAP具有操作簡便、結果穩(wěn)定和多態(tài)性豐富等特點?；蛲怙@子的G/C含量通常十分豐富，而非編碼區(qū)序列，如啟動子與內含子中A/T堿基較多，根據(jù)外顯子的特點開發(fā)特定的SRAP引物用于擴增特定的片段[4-5]。SRAP分子標記已成功應用于馬鈴薯（Solanum tuberosum）、玉米（Zea mays）、甜瓜（Cucumis melo）、芒果（Mangifera indica）、茄子（Solanum melongena）等植物的遺傳多樣性研究[6-9]。目前尚無見有關大花無柱蘭遺傳多樣性研究的報道。本研究采用SRAP分子標記技術，對10個居群的115份大花無柱蘭材料的基因組DNA進行PCR擴增，并進行遺傳多樣性分析，旨在為該物種的保護和合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大花無柱蘭實驗材料分別采集自溫州雁蕩山、臺州天臺山、寧海逐步和金華方巖山等10個樣地，共有樣品115份（見表1）。采樣時遵循隨機原則，同一居群不同樣點的間隔均在10 m以上。取新鮮、健康的葉片置于自封袋中，帶回實驗室后用大量的無菌水沖洗，晾干后置于－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 葉片DNA的提取

稱取0.1 g葉片放置在預冷的無菌研缽中，加入適量液氮用研棒磨成粉末。根據(jù)北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司的“新型植物基因組DNA快速提取試劑盒”的說明書提取DNA。

1.2.2 SRAP引物的篩選及PCR擴增

利用81對引物組合，對DNA樣品進行PCR擴增與分析，篩選出多態(tài)性好、重復性高的引物組合。PCR反應采用優(yōu)化后的體系（20 μL）：15.3 μL ddH2O、2.0 μL 10×緩沖液 、0.5 μL dNTPs（10mmol·L-1）、上游與下游引物各0.5 μL（20 μmol·L-1）、30 ng模板 DNA和0.4 μLTaqDNA聚合酶（2 U·μL-1）。PCR程序如下：94℃預變性5 min；94℃變性 1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共 5個循環(huán)；然后94℃處理1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，總共 35個循環(huán)；72℃延伸 10 min；PCR樣品保存于4℃冰箱備用。產物全部用于電泳，電泳在1%的瓊脂糖凝膠上進行，電泳45 min（電壓125 V、電流55 mA）后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照記錄。

表1 大花無柱蘭10個居群的基本信息Table1 Sampling information of ten Amitostigma pinguiculum populations

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳結果統(tǒng)計條帶數(shù)目，將強帶或可分辨的弱帶賦值“1”，其余賦值“0”，構建 0/1矩陣。利用PopGen 32軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算多態(tài)性條帶比率（percentage of polymorphic loci,PPB）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon's指數(shù)（I）、遺傳距離（D）、遺傳一致性、總的居群基因多樣性（Ht）、居群間基因分化度（Gst）和基因流（Nm）。采用Ntsys 2.0軟件構建聚類分析圖，參數(shù)采用默認值。

2 結果與分析

2.1 SRAP引物篩選及PCR擴增結果

引物篩選結果表明，共有9對引物可擴增出多態(tài)性豐富、重復性高、穩(wěn)定性好的條帶（見表2）。利用這9個引物組合對115份DNA樣品進行SRAPPCR擴增，共得到305條譜帶，片段大小主要在100～2 000 bp（見圖2）。這些譜帶均為多態(tài)性條帶，PPB為100%。引物組合擴增得到的條帶數(shù)在25～42，平均 33.89條；其中，ME5/em4組合擴增的條帶最多，其次為ME9/em8（40條），ME1/em5組合最少。擴增的條帶清晰且多態(tài)性豐富。

2.2 遺傳多樣性分析

在物種水平上，大花無柱蘭的多態(tài)性比率（PPB）為100%，Nei's基因多樣性指數(shù)（H）為0.209 8，Shannon's指數(shù)（I）為0.340 2；在居群水平上，PPB在24.59%～52.13%，平均為32.00%，其中HY的多態(tài)性最高，TT的多態(tài)性最低。H值在0.079 6～0.165 5，平均為0.100 9；I值在 0.120 9～0.252 3，平均為0.153 7。各居群H和I值的大小與PPB的高低大體一致，HY和FY 2個居群的大花無柱蘭具有較高的遺傳多樣性，而TT、XS和YD 3個居群的遺傳多樣性較低。

表2 SRAP引物序列及擴增結果Table2 SRAP primer sequences and the results of amplification

圖2 引物組合ME1/em5對部分大花無柱蘭樣品的SRAP擴增圖譜Fig.2 SRAP amplification profiles of some Amitostigma pinguiculum samples with primer combination ME1/em5

2.3 不同居群的遺傳分化

根據(jù)PopGen 32軟件的計算結果，大花無柱蘭總的居群基因多樣性（Ht）為0.210 7，居群間基因分化度（Gst）為0.520 9，基因流（Nm）為0.459 9。根據(jù)居群間基因分化度估算，52.09%的遺傳變異來自居群間，而47.91%的遺傳變異源自居群內，居群內的遺傳分化程度略低于居群間。

2.4 聚類分析

基于0/1矩陣，利用PopGen 32計算大花無柱蘭各居群之間的遺傳距離與遺傳一致性，結果表明，各居群的遺傳距離為0.091 9～0.198 4，平均為0.145 9；遺傳一致性為0.823 1～0.912 2，平均為0.867 5。HY和YD之間的遺傳距離最大，其次是HY與ZB，遺傳距離最小的是居群KC和LT（見表3）。遺傳一致性最低的是HY和YD，其次是HY和ZB，遺傳一致性最高的是KC和LT，遺傳距離和遺傳一致性兩者的表現(xiàn)規(guī)律一致。

由Nei's遺傳一致性，用非加權配對類平均（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGAM）法進行聚類分析。結果表明，10個居群的大花無柱蘭可分為3組，第1組包括布袋山、方巖山、括蒼山、蘭田、藤嶺、天臺山、西山和逐步8個居群；第2組僅雁蕩山1個居群；第3組僅劃巖山1個居群。第1組又可分為4個亞組，其中第1亞組包括布袋山和方巖山，第2亞組包括括蒼山和蘭田，第3亞組僅為藤嶺，第4亞組包括天臺山和西山（見圖3）。除方巖山外，聚為同一類的居群在地理位置上較近，說明地理分布與親緣關系的相關性較為顯著。

表3 大花無柱蘭10個居群的遺傳距離與Nei's遺傳一致性Table3 Genetic distance and Nei's genetic identity of ten Amitostigma pinguiculum populations

圖3 基于遺傳一致性的UPGAM聚類圖Fig.3 UPGAM dendrogram of Amitostigma pinguiculum based on genetic identity

3 討 論

我國是一個植物資源豐富的國家，但野生植物的保護沒有引起足夠的重視，生物多樣性正面臨嚴重威脅[10-11]。前人的研究結果表明，特有種或瀕危物種的遺傳變異水平通常比廣布種低[10,12-15]；但近年來有不少報道表明，部分瀕危物種或特有種具有較高的遺傳多樣性水平[12,16-17]。衡量遺傳多樣性的高低可以用PPB作為指標，其值越大，多樣性越高[18]。謝國文等[14]利用ISSR分子標記技術研究永瓣藤（Monimopetalum chinense）的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)永瓣藤的PPB僅為39.2%，其遺傳多樣性水平較低；汪小全等[15]發(fā)現(xiàn)銀杉（Cathaya argyrophylla）的PPB僅為32%，認為銀杉瀕危的原因之一是低水平的遺傳多樣性。而劉丹等[17]對中國特有植物鵝掌楸（Liriodendron chinense）進行RAPD分析的結果表明，該物種的PPB高達88.98%，表明其具有較高的遺傳多樣性，推測瀕危的原因是生殖隔離。本研究利用SRAP分子標記技術對10個居群的大花無柱蘭進行分析，在物種水平上其PPB為100%，H為0.209 8，I為0.340 2，多樣性指數(shù)均處于較高水平，表明大花無柱蘭具有豐富的遺傳多樣性。

大花無柱蘭居群間的基因分化度（Gst）為0.520 9，遠高于多年生草本植物（0.233）、特有種（0.248）和狹域種（0.242），表明大花無柱蘭在居群內和居群間均出現(xiàn)了較高水平的遺傳分化，其中有52.09%的遺傳變異存在于居群間，47.91%的遺傳變異存在于居群內，與王靜等[19]研究的瀕危植物連香樹（Cercidiphyllum japonicum）的結果相似。根據(jù)估算值的大小，基因流（Nm）分為高、中、低3個水平，而種群間的遺傳分化與Nm值呈負相關關系，高水平的基因流可以阻止居群之間的遺傳分化[20-21]。大花無柱蘭的Nm值為0.459 9，略小于0.5，基因流呈中等水平，可能不足以抵抗居群內因遺傳漂變引起的遺傳分化，推測有限的基因流可能導致其較高的遺傳分化水平。HAMRICK等[22]指出，異交和接觸性傳粉是植物保持較高遺傳多樣性的重要原因，大花無柱蘭具有較高水平的遺傳多樣性可能與此有關。大花無柱蘭的花朵具備引誘昆蟲的特征，在無柱蘭屬中花型最大，且花色艷麗、形狀奇特，推測對傳粉昆蟲具有較大的吸引力[1]。大花無柱蘭具有較高的遺傳多樣性和遺傳變異性，但植株數(shù)量很少，除人為采挖外，推測與大花無柱蘭對生境變化較為敏感有關。

4 結 論

以珍稀植物大花無柱蘭為材料，利用9個引物組合，共獲得305條譜帶。在物種水平上，多態(tài)性比率（PPB）為100%，Nei's基因多樣性指數(shù)（H）為0.209 8，Shannon's指數(shù)（I）為0.340 2；在居群水平上，PPB為24.59%～52.13%，H為0.079 6～0.165 5，I為0.120 9～0.252 3。居群基因分化度（Gst）為0.520 9，基因流（Nm）為0.459 9，遺 傳 距 離為0.091 9～0.198 4。大花無柱蘭的遺傳多樣性較為豐富，居群間存在一定的遺傳分化和基因交流，可采用就地保護和人工栽培等方式對該物種進行保護。