馮競(jìng)仰 陸冰 朱鴻 孫向軍 孫曉東

視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)位于脈絡(luò)膜與視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層之間，參與組成血-視網(wǎng)膜屏障，吞噬轉(zhuǎn)運(yùn)視循環(huán)產(chǎn)物，對(duì)維持光感受器細(xì)胞代謝和視網(wǎng)膜功能起著至關(guān)重要的作用。生理狀態(tài)下，RPE細(xì)胞不斷吞噬光感受器細(xì)胞外節(jié)脫落的膜盤(pán)以維持其日常代謝。隨著年齡增長(zhǎng)，部分不能被溶酶體消化的膜盤(pán)沉積在RPE細(xì)胞內(nèi)，形成脂褐素[1]。大量脂褐素堆積并釋放光化學(xué)毒性物質(zhì)導(dǎo)致RPE細(xì)胞損傷和功能減退，是年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)發(fā)病的重要機(jī)制之一[2-3]。N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanolamine，A2E)作為RPE細(xì)胞內(nèi)脂褐素的主要熒光基團(tuán)，可在430～480 nm波段內(nèi)的光照刺激下產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致RPE細(xì)胞損傷[4]。近年來(lái)，隨著對(duì)細(xì)胞損傷機(jī)制研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)除了經(jīng)典的線(xiàn)粒體相關(guān)凋亡途徑外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)同樣可以感知和整合損傷信號(hào)，參與細(xì)胞凋亡[5]。本研究通過(guò)建立A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷模型，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與RPE細(xì)胞損傷的過(guò)程，以及相對(duì)分子質(zhì)量70 000的熱休克蛋白5(heat shock 70 kDa protein 5，HSPA5)對(duì)RPE細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器人ARPE-19細(xì)胞株(American Type Culture Collection，美國(guó))，全反式視黃醛、乙醇胺(Sigma，美國(guó))，DMEM/F12(Dulbecco’s modified Eagle’s/Ham’s F12)11培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco，美國(guó))，CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天，中國(guó))，慢病毒質(zhì)粒LV-HSPA5-GFP-shRNA、LV-NC-GFP-shRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，HSPA5單克隆抗體(Cat.3216-1，Epitomics，美國(guó))，CHOP單克隆抗體(Cat.sc-7351)、caspase-12多克隆抗體(Cat.sc-70227)、β-actin單克隆抗體(Cat.sc-8432；Santa Cruz，美國(guó))。L18W/71型藍(lán)光燈(Osram，德國(guó))，5202型數(shù)字光照度計(jì)(Kyoritsu，日本)，IX70型倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)，680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad，美國(guó))等。

1.2 方法

1.2.1 RPE細(xì)胞培養(yǎng)人RPE細(xì)胞復(fù)蘇后加入DMEM/F12培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度，按12比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。使用胰蛋白酶溶液收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPE細(xì)胞，計(jì)數(shù)后稀釋至100× 106個(gè)·L-1。將細(xì)胞懸液依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求接種于培養(yǎng)皿，待RPE細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%融合后，換成無(wú)血清培養(yǎng)液，放置24 h后再接受處理。

1.2.2 A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷模型建立A2E由全反式視黃醛和乙醇胺依據(jù)參考文獻(xiàn)化學(xué)合成[4，6]。(1)A2E與RPE細(xì)胞共培養(yǎng)：將含25 μmol·L-1A2E的培養(yǎng)液加入RPE細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h；去除原培養(yǎng)液，溫PBS清洗細(xì)胞，充分洗去細(xì)胞外A2E，重新加入不含胎牛血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；運(yùn)用光學(xué)倒置顯微鏡觀察RPE細(xì)胞內(nèi)A2E顆粒情況；激光共聚焦顯微鏡觀察RPE細(xì)胞內(nèi)A2E自發(fā)熒光情況。(2)聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷：采用L18W/71型藍(lán)光燈在(460±20)nm照射A2E共培養(yǎng)后的RPE細(xì)胞20 min，光照在暗室中密閉進(jìn)行，無(wú)自然光干擾，電子溫度計(jì)監(jiān)測(cè)室溫為(37.0±0.3)℃，光照度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞水平上光照強(qiáng)度為4000 lux。對(duì)照組為不作任何處理的RPE細(xì)胞。

1.2.3 HSPA5 shRNA慢病毒載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒LV-HSPA5-GFP-shRNA(干擾序列5’-GCTCGACTCGAATTCCAAAGA-3’)和陰性對(duì)照LV-NC-GFP-shRNA(干擾序列5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)的構(gòu)建由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。將RPE細(xì)胞按每孔1.5 × 106個(gè)接種至24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，每孔加入0.5 mL凝膠胺，使其濃度為6 mg·L-1，室溫孵育30 min以提高細(xì)胞感染效率，再加入含shRNA慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，每孔200 μL，培養(yǎng)過(guò)夜后更換為新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用750 μg·L-1嘌呤霉素進(jìn)行藥物篩選，將篩選出的耐藥細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定沉默HSPA5基因的RPE細(xì)胞。細(xì)胞隨機(jī)分為3組：轉(zhuǎn)染HSPA5干擾序列的RPE細(xì)胞為HSPA5干擾組；轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列的RPE細(xì)胞為陰性干擾組；未轉(zhuǎn)染的RPE細(xì)胞為野生型組。轉(zhuǎn)染72 h后做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用熒光顯微鏡觀察RPE細(xì)胞內(nèi)GFP熒光表達(dá)，Western blot檢測(cè)HSPA5蛋白表達(dá)，驗(yàn)證HSPA5基因干擾有效性。

1.2.4 RPE細(xì)胞活力檢測(cè)采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RPE細(xì)胞，計(jì)數(shù)后稀釋至100×106個(gè)·L-1，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。按各實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶幚砑?xì)胞：(1)按1.2.2方法誘導(dǎo)A2E聯(lián)合藍(lán)光損傷RPE細(xì)胞后，分別培養(yǎng)3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，檢測(cè)細(xì)胞活力的變化；(2)按 1.2.3 方法處理細(xì)胞后，對(duì)HSPA5干擾組、陰性干擾組、野生型組RPE細(xì)胞均給予A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，檢測(cè)細(xì)胞活力的變化；(3)檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞活力。具體檢測(cè)方法為：去除培養(yǎng)液，溫PBS沖洗細(xì)胞，每孔加入含20 μL CCK-8試劑的培養(yǎng)液100 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。最終細(xì)胞活力結(jié)果表示為A2E處理組吸光度值與對(duì)照組吸光度值的比值。每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測(cè)RPE細(xì)胞培養(yǎng)于9 cm培養(yǎng)皿中，按各實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶幚砑?xì)胞：(1)按1.2.2方法誘導(dǎo)A2E聯(lián)合藍(lán)光損傷RPE細(xì)胞后，分別培養(yǎng)3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，檢測(cè)HSPA5和CHOP蛋白的表達(dá)變化；(2)按1.2.3方法處理細(xì)胞后，檢測(cè)HSPA5干擾組、陰性干擾組、野生型組HSPA5蛋白表達(dá)情況，之后對(duì)3組細(xì)胞均給予A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，檢測(cè)HSPA5、CHOP和Caspase-12蛋白的表達(dá)變化；(3)檢測(cè)對(duì)照組HSPA5、CHOP和Caspase-12蛋白的表達(dá)。具體檢測(cè)方法為：去除培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入細(xì)胞裂解液。收集細(xì)胞，于4 ℃ 下12 000 r·min-1離心5 min，取含蛋白的上清液。每100 μL蛋白樣品加入25 μL 蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴8 min。運(yùn)用SDS-PAGE對(duì)樣品中的蛋白進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。使用含50 g·L-1脫脂牛奶和體積分?jǐn)?shù)0.1%Tween-20的TBS封閉 2 h，分別加入11000稀釋的HSPA5抗體、1200稀釋的CHOP抗體、1200稀釋的Caspase-12抗體，于4 ℃孵育過(guò)夜。TBST沖洗后加入二抗，于37 ℃孵育2 h。使用ECL顯色，Bio-Rad凝膠成像儀采集圖像。運(yùn)用Image-J分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較組間差異性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，A2E共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，而對(duì)照組RPE細(xì)胞中未見(jiàn)明顯顆粒狀物質(zhì)。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，A2E共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞中A2E呈現(xiàn)綠色自發(fā)熒光，而對(duì)照組未觀察到該熒光。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，A2E聯(lián)合藍(lán)光處理后3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，RPE細(xì)胞活力分別是對(duì)照組的(80.9±6.2)%、(73.3±5.8)%、(70.6±5.4)%、(62.3±6.1)%和(51.4±4.5)%，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 RPE細(xì)胞損傷時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白HSPA5和CHOP表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子HSPA5蛋白表達(dá)在RPE細(xì)胞損傷后6 h顯著升高，12 h時(shí)達(dá)到高峰，之后逐漸下降。而CHOP作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡相關(guān)分子，在對(duì)照組表達(dá)量低，經(jīng)A2E及藍(lán)光處理后3 h CHOP蛋白表達(dá)出現(xiàn)升高，12 h時(shí)有小幅回落，24-48 h時(shí)又逐步上升(圖2)。提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷。

圖1 A2E與RPE細(xì)胞共培養(yǎng)。A：倒置相差顯微鏡下，A2E共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒；B：倒置相差顯微鏡下，對(duì)照組中未見(jiàn)明顯顆粒狀物質(zhì)；C：激光共聚焦顯微鏡下，A2E共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞中A2E呈綠色自發(fā)熒光；D：激光共聚焦顯微鏡下，對(duì)照組中未觀察到該熒光

圖2 Western blot檢測(cè)A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷后HSPA5和CHOP蛋白表達(dá)。與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.3 HSPA5基因干擾RPE細(xì)胞穩(wěn)株獲得為了驗(yàn)證HSPA5基因干擾的RPE細(xì)胞是否穩(wěn)定且有效，通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，慢病毒處理RPE細(xì)胞后72 h，HSPA5干擾組細(xì)胞內(nèi)存在GFP熒光表達(dá)，提示RPE細(xì)胞已被LV-HSPA5-GFP-shRNA有效轉(zhuǎn)染。采用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞中HSPA5蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，慢病毒處理72 h后，HSPA5干擾組中HSPA5蛋白表達(dá)較野生型組顯著下降(P<0.05)，而陰性干擾組HSPA5蛋白表達(dá)與野生型組相比未受明顯抑制(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 沉默HSPA5加重A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，A2E聯(lián)合藍(lán)光損傷RPE細(xì)胞后12 h，HSPA5干擾組中HSPA5蛋白表達(dá)較野生型組和陰性干擾組均明顯下降(均為P<0.05)。HSPA5干擾組與野生型組、陰性干擾組相比CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)均顯著提高(均為P<0.05)。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，A2E聯(lián)合藍(lán)光處理RPE細(xì)胞后12 h，HSPA5干擾組RPE細(xì)胞活力降低至(56.3±5.1)%，較野生型組(72.9±7.1)%和陰性干擾組(70.3±6.6)%均顯著降低(均為P<0.05)。提示HSPA5基因干擾可上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白CHOP、Caspase-12的表達(dá)，并加重A2E及藍(lán)光對(duì)RPE細(xì)胞的損傷。見(jiàn)圖4。

圖3 HSPA5基因干擾RPE細(xì)胞穩(wěn)株獲得。A：光鏡下LV-HSPA5-GFP-shRNA轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞后72 h，HSPA5干擾組細(xì)胞(標(biāo)尺：50 μm);B:熒光顯微鏡下LV-HSPA5-GFP-shRNA轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞后72 h，HSPA5干擾組細(xì)胞內(nèi)存在GFP熒光表達(dá)(標(biāo)尺：50 μm)；C：Western blot檢測(cè)電泳結(jié)果；D：Western blot檢測(cè)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，慢病毒處理72 h后，HSPA5干擾組中HSPA5蛋白表達(dá)較野生型組顯著下降(*P<0.05)，而陰性干擾組HSPA5蛋白表達(dá)未受明顯抑制

圖4 沉默HSPA5加重A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷。A：Western blot檢測(cè)電泳結(jié)果；B：Western blot檢測(cè)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，A2E聯(lián)合藍(lán)光損傷RPE細(xì)胞后12 h，HSPA5干擾組中的HSPA5蛋白表達(dá)較野生型組和陰性干擾組均明顯下降(*P<0.05)，CHOP和Caspase-12蛋白在HSPA5干擾組中的表達(dá)與野生型組和陰性干擾組相比均顯著提高(*P<0.05)；C：細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，A2E聯(lián)合藍(lán)光損傷RPE細(xì)胞后12 h，HSPA5干擾組RPE細(xì)胞活力較野生型組和陰性干擾組均顯著降低(*P<0.05)

3 討論

RPE細(xì)胞對(duì)維持光感受器細(xì)胞代謝和視網(wǎng)膜功能起著至關(guān)重要的作用。隨著年齡增長(zhǎng)，脂褐素積聚于RPE細(xì)胞內(nèi)，持續(xù)暴露于可見(jiàn)光、紫外線(xiàn)等，誘發(fā)光化學(xué)毒性物質(zhì)釋放，導(dǎo)致RPE細(xì)胞損傷是AMD病理改變的始動(dòng)環(huán)節(jié)。正常RPE細(xì)胞可通過(guò)自噬及溶酶體相關(guān)途徑逐步降解被吞噬的膜盤(pán)，以保持RPE細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。然而，隨著RPE細(xì)胞的衰老，其處理代謝產(chǎn)物的能力下降，大量有害物質(zhì)無(wú)法被清除，形成脂褐素積聚。有研究證實(shí)，老年人視網(wǎng)膜黃斑部RPE細(xì)胞內(nèi)脂褐素可占到整個(gè)細(xì)胞面積的約20%[7]。Eldred[8]從老年人視網(wǎng)膜組織中提取出大量脂褐素顆粒，并從中分離出其主要熒光基團(tuán)A2E。A2E具有很強(qiáng)的光化學(xué)毒性，尤其對(duì)藍(lán)光敏感。本研究觀察到RPE細(xì)胞吞噬了A2E后，在藍(lán)光照射下細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著下降，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞損傷加重。有研究表明，在藍(lán)光激發(fā)下，A2E會(huì)發(fā)生光氧化反應(yīng)產(chǎn)生多種活性氧，包括單態(tài)氧、過(guò)氧化物等[9]。一方面這些活性氧可以攻擊細(xì)胞的線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、DNA雙鏈等，直接導(dǎo)致RPE細(xì)胞損傷[10]，另一方面又可以誘導(dǎo)A2E之間通過(guò)C-C雙鍵結(jié)合，形成A2E的環(huán)氧化合物。這些環(huán)氧化合物既能進(jìn)一步加速活性氧生成，又能導(dǎo)致RPE細(xì)胞損傷[11]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以感知和整合損傷信號(hào)，參與細(xì)胞凋亡，在AMD發(fā)病機(jī)制中起重要作用[12]。作為真核細(xì)胞中新合成蛋白質(zhì)折疊與組裝的加工廠，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)外界應(yīng)激因素十分敏感。在各種應(yīng)激原刺激下，大量錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)聚集，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[13]。本研究結(jié)果顯示，A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子HSPA5和CHOP蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著升高。HSPA5又稱(chēng)免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，是熱休克蛋白70家族成員之一，長(zhǎng)期位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器和關(guān)鍵分子伴侶[14]。生理狀態(tài)下，HSPA5通常與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的三種跨膜蛋白，即類(lèi)RNA依賴(lài)蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(ATF6)、肌醇依賴(lài)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至細(xì)胞核信號(hào)激酶1(IRE1)結(jié)合，處于休眠狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生初期，HSPA5與跨膜蛋白解離，啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)，同時(shí)自身表達(dá)上調(diào)，輔助蛋白質(zhì)正確折疊，清除異常蛋白，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞生存[15]。本研究中HSPA5蛋白在RPE細(xì)胞損傷早期升高，提示在A2E及藍(lán)光照射刺激下，RPE細(xì)胞出現(xiàn)一系列內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，早期通過(guò)上調(diào)HSPA5蛋白表達(dá)，協(xié)助異常蛋白折疊并啟動(dòng)降解途徑，從而促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。而RPE細(xì)胞損傷后48 h，HSPA5蛋白水平呈下降趨勢(shì)，推測(cè)持續(xù)劇烈的應(yīng)激導(dǎo)致RPE細(xì)胞不可逆損傷，從而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑。

CHOP作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑中重要調(diào)控分子之一，在正常生理?xiàng)l件下表達(dá)量較低，當(dāng)受到應(yīng)激刺激時(shí)，CHOP表達(dá)水平升高，提示細(xì)胞啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑[16]。有趣的是本研究發(fā)現(xiàn)，RPE細(xì)胞損傷后CHOP蛋白表達(dá)趨勢(shì)并不是持續(xù)增高，而是呈現(xiàn)2個(gè)高峰，分別在損傷后6 h和48 h。我們推測(cè)第一個(gè)高峰可能是由于A2E及藍(lán)光急性損傷RPE細(xì)胞所致，而后RPE細(xì)胞啟動(dòng)一系列防御機(jī)制，包括上調(diào)HSPA5激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)降解途徑等，在一定程度上清除有害物質(zhì)，修復(fù)細(xì)胞功能，維持RPE細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。然而隨著時(shí)間延長(zhǎng)，損傷超過(guò)RPE細(xì)胞代償能力，最終走向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑。

本研究結(jié)果還表明，當(dāng)基因干擾HSPA5表達(dá)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡相關(guān)分子CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)增高，并且加重了A2E及藍(lán)光對(duì)RPE細(xì)胞的損傷。這一結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，HSPA5具有部分抵抗凋亡蛋白CHOP和Caspase-12的作用，減輕A2E及藍(lán)光對(duì)RPE細(xì)胞的損傷。有研究認(rèn)為，HSPA5激活是細(xì)胞在面對(duì)應(yīng)激時(shí)一種重要的防御機(jī)制，該機(jī)制對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用[17]。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞的HSPA5水平普遍較正常細(xì)胞高，它可能參與降低細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，抵抗癌細(xì)胞凋亡[18]。在年齡相關(guān)性神經(jīng)退行性疾病研究中也發(fā)現(xiàn)，抑制HSPA5可以增加神經(jīng)元對(duì)β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性，而提高HSPA5表達(dá)則可以保護(hù)海馬部位神經(jīng)元，減輕β淀粉樣蛋白沉積對(duì)其造成的損傷[19-20]。

綜上所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與A2E聯(lián)合藍(lán)光誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞損傷。HSPA5具有調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，減輕A2E及藍(lán)光誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，促進(jìn)RPE細(xì)胞存活的作用。本研究初步揭示了AMD中RPE細(xì)胞損傷機(jī)制，為今后早期干預(yù)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)和代償機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為AMD潛在治療靶點(diǎn)研究提供了新思路。