趙璐 粘紅 韋燕凱 金成成 李娜 陳思思 魏瑞華

干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)是一種慢性自身免疫性干眼類型，主要侵犯唾液腺和淚腺，表現(xiàn)為口眼干燥[1]。SS發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前仍缺乏有效的治療方法，有研究表明，Th17細(xì)胞作為致炎細(xì)胞群在SS發(fā)病過(guò)程中起到了重要作用[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來(lái)源于中胚層的多能干細(xì)胞，具有低免疫原性及免疫抑制特性。研究表明，MSCs可通過(guò)抑制Th17細(xì)胞的活化與增殖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[3-6]。同時(shí)有研究表明，白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO) 等基因可增強(qiáng)MSCs的治療效能[7-8]。因此，本研究旨在構(gòu)建IL-10 基因修飾的兔脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(interleukin-10 gene-modified adipose mesenchymal stem cells，IL-10-ADSCs)，探究其對(duì)兔外周血Th17細(xì)胞的免疫調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性新西蘭大白兔，體質(zhì)量為2.5～3.0 kg(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)，實(shí)驗(yàn)前排除眼部炎癥及其他異常，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及喂養(yǎng)遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 主要試劑與儀器慢病毒包裝細(xì)胞人胚腎293T細(xì)胞株(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))；ADSCs細(xì)胞(天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院眼科研究所)；pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro載體質(zhì)粒及輔助包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2.G(上海漢恒生物有限公司)；大腸桿菌菌株DH5α、RNA提取試劑Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒(北京康為世紀(jì)有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基、聚乙二醇8000、I型膠原酶(美國(guó)Gibco公司)；2×濃縮定量即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，Q-PCR)擴(kuò)增混合液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶(美國(guó)Thermo公司)；小鼠抗兔DYKDDDDK Tag一抗、HRP標(biāo)記馬抗小鼠IgG二抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)GE公司)；7900HTFAST Q-PCR儀(愛(ài)普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易上海有限公司)。

1.2 IL-10重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

1.2.1 IL-10基因片段的制備從GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得兔IL-10的mRNA序列，設(shè)計(jì)引物序列如下：上游引物：5’-ATATGAATTCGCCACCATGCTCAGCTCAGCTCT-3’；下游引物：5’-ATATGGATCCGCTTTTTATCTTCATTGTCATGTA-3’(引物說(shuō)明：下劃線為交換配對(duì)堿基，酶切位點(diǎn))。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的反應(yīng)體系為模板DNA 0.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，10× PCR 緩沖液5.0 μL，脫氧核糖核苷三磷酸 5.0 μL，高保真PCR酶1.0 μL，硫酸鎂2.0 μL，加超純水至50.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸90 s，25個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，按照DNA 凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收DNA 片段。

1.2.2 重組質(zhì)粒pHBLV-IL-10的構(gòu)建及鑒定用EcoR I和BamH I分別對(duì)IL-10 PCR產(chǎn)物和pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切完成后進(jìn)行膠回收，用T4 DNA連接酶連接后，用DH5α感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化，涂布含有氨芐抗性的瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單克隆菌落，37 ℃、250 r·min-1搖菌14 h后進(jìn)行菌液PCR 鑒定，陽(yáng)性克隆菌送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。

1.2.3 pHBLV-IL-10慢病毒的包裝質(zhì)粒高純度無(wú)內(nèi)毒素大量抽提，在轉(zhuǎn)染前1 d將培養(yǎng)至P3代的293T細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)用于轉(zhuǎn)染，取兩支滅菌離心管，分別加入質(zhì)粒DNA(pSPAX2、pMD2.G、pHBLV-IL-10遵循摩爾比111，共24 μg)或LipoFiterTM(48 μL)與DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的混合液于室溫孵育5 min。將兩支離心管中DNA溶液與LipoFiterTM溶液混合均勻，室溫孵育20 min后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基。分別收集培養(yǎng)48 h及72 h富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清。4 ℃、2000 r·min-1離心15 min去除細(xì)胞雜質(zhì)，0.45 μm濾器過(guò)濾上清液后每30 mL加入高壓滅菌5×聚乙二醇8000 NaCl母液7.5 mL，4 ℃搖床過(guò)夜，第2天7110 r·min-1離心20 min，DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸沉淀分裝于EP管中于-80 ℃儲(chǔ)存。

1.2.4 重組慢病毒滴度檢測(cè)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞按每孔10×103個(gè)接種于96孔板。第2天取6個(gè)無(wú)菌EP管分別加入90 μL完全培養(yǎng)基，取10 μL病毒原液加入到第1個(gè)EP管中，吹打混勻后吸取10 μL加入到第2個(gè)EP管中，連續(xù)6次做10倍梯度稀釋。將梯度稀釋的病毒加入293T細(xì)胞孵育過(guò)夜，24 h后換液，72 h后熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。對(duì)熒光比例10%～30%的孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算滴度。滴度計(jì)算：滴度(TU·mL-1)=細(xì)胞數(shù)×熒光百分比×103/病毒原液體積(μL)。

1.3 IL-10-ADSCs的構(gòu)建與鑒定

1.3.1 重組慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ADSCsADSCs分離提純及鑒定方法同前期文獻(xiàn)[9]，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ADSCs細(xì)胞接種于24孔板，第2天細(xì)胞匯合度達(dá)50%～70%時(shí)進(jìn)行慢病毒感染，24 h后換液，48 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)效率。

1.3.2 Q-PCR檢測(cè)IL-10基因的表達(dá)提取感染慢病毒后ADSCs細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Q-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-10 mRNA表達(dá)水平。384孔板中分別加入1 μL上游引物，1 μL下游引物(引物序列：上游引物：5’-CAACAGAGAGCAGGACGTGAGACT-3’，下游引物：5’-GCATCTTGGCTTTGGTACTGAGCT)，4 μL 2×濃縮Q-PCR擴(kuò)增混合液以及2 μL cDNA，封板膜封閉后渦旋離心，離心結(jié)束后，將384孔板放入Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time PCR儀中，設(shè)置參數(shù)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 Western blot檢測(cè)IL-10蛋白的表達(dá)消化離心收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。100 μg等量蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、50 g·L-1脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加小鼠抗兔DYKDDDDK Tag一抗(1500)及小鼠抗兔β-actin二抗(12000)4 ℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；HRP標(biāo)記馬抗小鼠IgG二抗(12000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；DAB顯色檢測(cè)蛋白表達(dá)(pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro載體自帶3×FLAG標(biāo)簽)。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)感染慢病毒后ADSCs干細(xì)胞特性提取感染慢病毒后ADSCs細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰浴中按次序分別將1.0 μL cDNA，2.0 μL上下游引物，12.5 μL 2×Taq逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)預(yù)混試劑以及7.5 μL雙蒸水加入至200.0 μL EP管中，將上述混合液離心后置于RT-PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min后進(jìn)入循環(huán)階段：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)30～35次，最后 72 ℃ 保溫5 min。反應(yīng)結(jié)束后加樣行瓊脂糖凝膠電泳。加樣：RT-PCR marker：1 μL marker+1 μL上樣緩沖液+4 μL TAE電泳緩沖液，RT-PCR樣品：5 μL樣品DNA+1 μL上樣緩沖液，混勻后依次加入瓊脂糖凝膠孔中，100 V、50 mA電泳40 min，凝膠成像儀成像分析ADSCs中GAPDH、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90基因的表達(dá)。RT-PCR引物序列：GAPDH：上游引物：5’-AACATCATCCCTGCCTCTA-CTG-3’，下游引物：5’-CTCCGACGCCTGCTTCAC-3’；CD29：上游引物：5’-CAAGAAGGAATGCCTACGTC-3’，下游引物：5’-CAATGCCACCAAGTTTCCCAT-3’；CD34：上游引物：5’-AGAACTTTCCAGCATGTTCCAGTTTATG-3’，下游引物：5’-GGCTTGCCACATCTTGCTCGGTGA-3’；CD44：上游引物：5’-CACCACGGATTTCTGACCAC-3’，下游引物：5’-TCCAAGC-CTCCATGTAATGT-3’；CD45：上游引物：5’-TTACCTGGACACCTCCTCAA-3’，下游引物：5’-TTCATCATCCCTTTCAACAA-3’；CD73：上游引物：5’-CCACTTCTCAAAGAGGCTAA-3’，下游引物：5’-GAAGAATAGGATTTCCGTGT-3’；CD90：上游引物：5’-CATTTCCCTGTGACTGGTTG-3’，下游引物：5’-CTGGCTTCCCTTGTCATAAA-3’。

1.4 IL-10-ADSCs對(duì)兔外周血Th17細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

1.4.1 建立淚腺上皮細(xì)胞與自體外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系分離兔淚腺上皮細(xì)胞及外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，方法同前期文獻(xiàn)[9]。將兔淚腺上皮細(xì)胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后進(jìn)行γ射線照射(照射劑量為2500 RAD)，使其喪失增殖能力但保留其抗原性(表達(dá)MHCⅡ分子)。將其與PBMCs以11的比例混合培養(yǎng)3 d后，按PBMCsADSCs為51的比例加入等量的ADSCs、IL-10-ADSCs和GFP-ADSCs(前期研究表明ADSCs可抑制外周血T淋巴細(xì)胞的增殖，ADSCs與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)比例為51時(shí)抑制效果最好[9])，同時(shí)以等量的成人真皮成纖維細(xì)胞-α作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，共培養(yǎng)2 d后，收集混合培養(yǎng)體系中細(xì)胞。

1.4.2 IL-10-ADSCs對(duì)兔外周血Th17細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響將1.4.1中收集的混合培養(yǎng)的細(xì)胞加入適量Trizol進(jìn)行總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，Q-PCR檢測(cè)Th17細(xì)胞分化相關(guān)基因IL-17、維甲酸相關(guān)孤獨(dú)受體C(retinoicacid orphan receptor C，RORC) mRNA表達(dá)水平，引物序列：GAPDH：上游引物：5’-GGGTGGTGGACCTCATGGT-3’，下游引物：5’-CGGTGGTTTGAGGGCTCTTA-3’；IL-17：上游引物：5’-GGAATGAGGACCACCACATGA-3’，下游引物：5’-CTGCGTAGGACCAGGATCTCTT-3’；RORC：上游引物：5’-GGCCTACCACGCCGA-3’，下游引物：5’-TCCATGCCACCGTATTTGC-3’。相對(duì)定量結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上樣本比較采用單因素方差分析(ANOVA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 IL-10重組慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 重組質(zhì)粒pHBLV-IL-10的構(gòu)建及鑒定兔IL-10目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，基因片段大小為534 bp，大小與預(yù)期結(jié)果相符，見(jiàn)圖1A。挑取細(xì)菌培養(yǎng)皿單克隆菌落，過(guò)夜搖菌后進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小約為900 bp(PCR擴(kuò)增用的是載體上的一段通用引物，故應(yīng)該比534 bp大300 bp左右)，見(jiàn)圖1B。將陽(yáng)性克隆菌液送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果顯示基因序列正確，重組慢病毒載體構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2。

圖1 IL-10重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定。A：PCR擴(kuò)增IL-10基因片段；B：IL-10過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定。1-8代表的是挑取的8個(gè)單克隆菌落

圖2 pHBLV-IL-10載體測(cè)序結(jié)果。陽(yáng)性克隆菌基因測(cè)序結(jié)果表明重組慢病毒載體構(gòu)建成功

2.1.2 慢病毒包裝與滴度檢測(cè)將pSPAX2、pMD2.G、pHBLV-IL-10共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝，分別于轉(zhuǎn)染后48 h及72 h熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，見(jiàn)圖3。收集48 h及72 h病毒上清經(jīng)5×聚乙二醇8000濃縮后獲得的病毒顆粒進(jìn)行滴度的測(cè)定，見(jiàn)圖4。對(duì)熒光比例合適(10%)的孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算滴度。滴度計(jì)算結(jié)果為1.2×109TU·mL-1。滴度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。

2.2 IL-10-ADSCs的構(gòu)建與鑒定用濃縮后的慢病毒顆粒感染ADSCs，48 h熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)效率約為80%以上，見(jiàn)圖5A。應(yīng)用Q-PCR對(duì)IL-10-ADSCs組及GFP-ADSCs組細(xì)胞中IL-10 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，與GFP-ADSCs組相比，IL-10-ADSCs組IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖5B。Western blot檢測(cè)IL-10蛋白水平相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，目標(biāo)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小約為22 000，與預(yù)期結(jié)果一致。與GFP-ADSCs組相比，IL-10-ADSCs組在蛋白水平過(guò)表達(dá)IL-10，見(jiàn)圖5C。利用RT-PCR檢測(cè)IL-10-ADSCs相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志分子基因水平的表達(dá)，結(jié)果顯示IL-10-ADSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90等MSCs標(biāo)志物，不表達(dá)CD34、CD45等造血細(xì)胞標(biāo)志物，說(shuō)明IL-10-ADSCs仍然具有干細(xì)胞特性，見(jiàn)圖5D。

圖3 IL-10重組慢病毒包裝48 h(A)及72 h(B)GFP表達(dá)情況(×4)。熒光顯微鏡下觀察慢病毒包裝48 h及72 h GFP表達(dá)率可達(dá)90%以上

圖4 梯度稀釋病毒計(jì)算病毒滴度(×20)。對(duì)濃縮后的病毒連續(xù)6次行10倍梯度稀釋后感染293T細(xì)胞進(jìn)行滴度計(jì)算，每孔所加病毒量分別為A(10 μL)、B(10-1 μL)、C(10-2 μL)、D(10-3 μL)、E(10-4 μL)、F(10-5 μL)，圖為感染72 h后熒光顯微鏡下GFP表達(dá)情況，選取第3孔細(xì)胞(感染率約10%)消化計(jì)數(shù)進(jìn)行滴度的計(jì)算(圖4C)

圖5 IL-10-ADSCs的構(gòu)建與鑒定。A：慢病毒感染ADSCs 48 h GFP表達(dá)情況(×4)；B：Q-PCR檢測(cè)IL-10 mRNA表達(dá)水平；C：Western blot檢測(cè)IL-10蛋白表達(dá)水平(載體自帶3×FLAG標(biāo)簽，故目標(biāo)蛋白采用小鼠抗兔DYKDDDDK Tag一抗)；D：RT-PCR鑒定IL-10-ADSCs干細(xì)胞特性

2.3 IL-10-ADSCs抑制兔外周血Th17細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)Q-PCR檢測(cè)混合培養(yǎng)體系細(xì)胞中Th17細(xì)胞分化相關(guān)基因IL-17、RORC mRNA表達(dá)水平。與對(duì)照組IL-17、RORC mRNA的表達(dá)量(IL-17：1.000±0.016；RORC：1.000±0.021)相比，IL-10-ADSCs組(IL-17：0.203±0.160；RORC：0.371±0.190)、ADSCs組(IL-17：0.508±0.296；RORC：0.632±0.061)及GFP-ADSCs組(IL-17：0.539±0.202；RORC：0.549±0.008)均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。同時(shí)IL-10-ADSCs組對(duì)IL-17、RORC mRNA抑制效果大于ADSCs組和GFP-ADSCs組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，ADSCs組與GFP-ADSCs組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。結(jié)果表明，MSCs可抑制反應(yīng)體系中T細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化，且IL-10-ADSCs組抑制效果較基因修飾前更加顯著(圖6)。

圖6 IL-10-ADSCs抑制兔外周血Th17細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)。IL-10-ADSCs組與對(duì)照組比較，*P<0.05，***P<0.001；IL-10-ADSCs組與ADSCs組比較，$P<0.05，$$P<0.01；ADSCs組與GFP-ADSCs組比較，nsP>0.05

3 討論

近年來(lái)干細(xì)胞療法為SS等自身免疫性疾病的治療帶來(lái)了希望，研究表明MSCs對(duì)自身免疫性疾病的治療效果很大程度上依賴于其免疫調(diào)節(jié)因子的分泌。因此，用特定的免疫調(diào)節(jié)因子對(duì)MSCs進(jìn)行基因修飾可能會(huì)最大限度地發(fā)揮其治療作用[4，10]。本研究預(yù)通過(guò)構(gòu)建IL-10-ADSCs，探究其是否能增強(qiáng)ADSCs對(duì)Th17細(xì)胞的免疫調(diào)控作用。

眾所周知，IL-10是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是目前公認(rèn)的炎癥與免疫抑制因子[11]。Trittibach等[12]研究表明，IL-10可以有效減少葡萄膜炎模型小鼠前房及后房炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生。我們的前期研究通過(guò)腺病毒介導(dǎo)IL-10轉(zhuǎn)基因的方式治療自身免疫性干眼也取得了一定的治療效果[13]。但無(wú)論是體外重組還是腺病毒介導(dǎo)都無(wú)法有效維持IL-10有效的治療濃度，長(zhǎng)期反復(fù)注射還易產(chǎn)生抗IL-10抗體。應(yīng)用重組慢病毒載體對(duì)MSCs進(jìn)行基因修飾很好地解決了上述問(wèn)題，本研究中我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)IL-10基因的IL-10-ADSCs，且在基因修飾后并未影響其干細(xì)胞特性。

研究表明，Th17細(xì)胞是參與自身免疫性干眼的主要細(xì)胞群[14-15]。IL-17作為T(mén)h17細(xì)胞的主要效應(yīng)分子，已被證明與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。IL-17作為細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)子，可刺激IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α等細(xì)胞因子的生成，從而引起一系列的病理改變[17]。研究表明，SS患者血清中IL-17表達(dá)水平隨病情的嚴(yán)重程度升高，在SS小鼠模型中也同樣發(fā)現(xiàn)唾液腺及血清中IL-17表達(dá)水平升高[18-19]。Lin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，IL-17基因敲除的小鼠無(wú)法誘導(dǎo)形成SS，而在過(guò)繼轉(zhuǎn)移Th17細(xì)胞后則出現(xiàn)顯著的唾液分泌量下降、自身抗體產(chǎn)生增加等SS臨床癥狀。RORC是Th17細(xì)胞分化過(guò)程中關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，在Th17分化及介導(dǎo)自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。研究表明RORC缺失會(huì)阻止CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，而過(guò)表達(dá)RORC的CD4+T細(xì)胞在不需要外來(lái)細(xì)胞因子的情況下即可產(chǎn)生IL-17；同時(shí)有研究表明RORC基因敲除的小鼠，自身免疫性疾病發(fā)生率下降，Th17 細(xì)胞數(shù)量也相應(yīng)減少[21-22]。在前期的研究中，我們也發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞參與了自身免疫性干眼模型中炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9，23]。

基因修飾MSCs調(diào)控Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)已得到廣泛的研究，Mohammadzadeh等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性腦脊髓炎治療過(guò)程中，與ADSCs相比，β干擾素基因修飾的ADSCs可更大程度降低IL-17的分泌。Wang等[25]探究IL-35基因修飾的MSCs在誘導(dǎo)心臟移植免疫耐受中的作用，結(jié)果表明IL-35基因修飾的干細(xì)胞在抑制Th17免疫反應(yīng)及減少移植物排斥反應(yīng)方面顯示出更大的優(yōu)勢(shì)。與上述研究結(jié)果一致，本研究為探究IL-10-ADSCs對(duì)Th17細(xì)胞的免疫調(diào)控作用，我們觀察了ADSCs、IL-10-ADSCs及GFP-ADSCs對(duì)體外激活T淋巴細(xì)胞相關(guān)炎性因子的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，三組均可降低兔外周血Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17 mRNA及其轉(zhuǎn)錄因子RORC mRNA表達(dá)水平(均為P<0.05)，值得注意的是，IL-10-ADSCs對(duì)Th17細(xì)胞的抑制效果較ADSCs進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.05)。

綜上所述，ADSCs在IL-10基因修飾后對(duì)Th17細(xì)胞免疫調(diào)控作用增強(qiáng)，這提示其對(duì)自身免疫性干眼可能具有更佳的治療效果，為我們后期探索自身免疫性干眼發(fā)病機(jī)制以及優(yōu)化治療方案做了前期實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。但I(xiàn)L-10-ADSCs究竟通過(guò)何種途徑對(duì)Th17細(xì)胞產(chǎn)生免疫調(diào)控，其他細(xì)胞因子是否也參與其中仍有待進(jìn)一步研究。