朱超，楊晨，馮琛，錢軍

（1.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 腫瘤外科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233000）

0 引言

乳腺癌為臨床常見惡性腫瘤，為女性癌癥中發(fā)病率和死亡率均較高的疾病。臨床上通常將乳腺癌分為兩種亞型：三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌。三陰性乳腺癌的臨床治療手段有限，短期內(nèi)容易復發(fā)轉移，其復發(fā)和轉移的生物學機制為學者們研究的熱點[1]。目前得到證實的是，腫瘤細胞上皮間充質(zhì)轉化（Epithelial mesenchymal transformation，EMT）參與了多種惡性腫瘤復發(fā)和轉移的發(fā)生發(fā)展過程[2]。因此對于三陰性乳腺癌的EMT 過程及生物學機制的相關研究具有重要的意義。本研究對三陰性乳腺癌細胞的EMT 過程及其生物學特征進行了分析。

1 材料和方法

1.1 細胞株、試劑、儀器

（1）乳腺癌細胞株：人三陰性乳腺癌細胞株BT-549、人非三陰性乳腺癌細胞株MCF-7 均購于中國科學院細胞庫。BT-549、MCF-7 分別用L-15、DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在5%二氧化碳，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3 天后傳代1 次，取對數(shù)生長期的細胞用于本次研究。

（2）主要試劑和儀器，主要試劑：L-15、DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），胎牛血清（杭州四季青試劑公司），青鏈雙抗混懸液（北京索萊寶公司），胰蛋白酶（美國Sigma 公司）、細胞波形蛋白（Vinmentin）、上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）、間質(zhì)細胞鈣粘蛋白（N-cadherin）一抗、二抗（美國Cell Signaling Technology 公司）、DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

主要儀器：潔凈工作臺（蘇州空氣技術有限公司，BCM-100A 型），二氧化碳培養(yǎng)箱、微生物培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱（天津泰斯特儀器有限公司），倒置顯微鏡（德國Leica 公司），凝膠成像儀（美國 BIORAD，Gel Doc XR），Western 電泳儀（美國 BIORAD，164-5051），Trans-Blot Turbo 全能型蛋白轉印系統(tǒng)（美國 Bio-rad 170-4150）

1.2 方法

（1）Western Blotting 檢測蛋白表達：總蛋白的提取→BCA 法蛋白濃度的測定→SDS—PAGE 電泳→轉膜→封閉、抗原抗體反應→顯色

（2）平板克隆細胞增殖實驗：細胞消化、計數(shù)、配制成細胞懸液（濃度1×103個/mL），加入6 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 周（37℃，5%CO2），當達到滿意克隆數(shù)時終止培養(yǎng)。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞，甲醇固定，染色，計數(shù)。

（3）Transwell 細胞侵襲轉移實驗：無血清培養(yǎng)基包被Transwell 小室底部膜上室面，4℃風干，加入無血清培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)30 分鐘。終止消化，PBS 清洗，重懸。調(diào)整細胞密度至1-5×105個/mL。Transwell 小室中加入細胞懸液，置于24 孔培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，接種1 h 后，0.1%伊紅染色。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（）表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)或百分比表示。假設檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 兩組細胞EMT 相關蛋白表達水平比較

我們通過Western Blotting 檢測兩組細胞EMT 相關基因蛋白（上皮表型的標志分子E-cadherin，間質(zhì)表型的標志分子N-cadherin、Vimentin）表達水平的差異。結果顯示，三陰性乳腺癌細胞上皮表型的標志分子E-cadherin 表達低于非三陰性乳腺癌細胞，而其間質(zhì)表型的標志分子N-cadherin、Vimentin 表達高于非三陰性乳腺癌細胞（見圖1）。

圖1 兩組細胞EMT 相關基因蛋白表達水平的差異

2.2 三陰性和非三陰性乳腺癌細胞增殖能力比較

統(tǒng)計結果顯示，三陰性乳腺癌細胞的克隆形成率明顯多于非三陰性乳腺癌細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1，圖2。

表1 兩組細胞克隆率比較（）

表1 兩組細胞克隆率比較（）

圖2 兩組細胞克隆形成圖

2.3 三陰性和非三陰性乳腺癌細胞侵襲及轉移能力比較

統(tǒng)計結果顯示，三陰性乳腺癌細胞的侵襲細胞數(shù)目、轉移細胞數(shù)目均明顯多于非三陰性乳腺癌細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2，圖3。

表2 兩組侵襲細胞數(shù)目及轉移細胞數(shù)目比較（）

表2 兩組侵襲細胞數(shù)目及轉移細胞數(shù)目比較（）

圖3 兩組乳腺癌細胞侵襲及轉移細胞數(shù)目

3 討論

EMT 是細胞骨架重組，上皮細胞轉變?yōu)殚g質(zhì)細胞表型的過程，因間質(zhì)細胞具有明顯的遷移能力，因此推測EMT 的發(fā)生對于腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力具有積極的促進作用[3]。SBEM 為一種分泌性蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，SBEM 能夠通過EMT 促進三陰性乳腺癌的侵襲和轉移[4]。E-cadherin 的表達與三陰性乳腺癌腫瘤大小、組織學分級和淋巴結轉移呈負相關[5]。Vimentin 是EMT 重要的間質(zhì)表型標志分子，其高表達提示乳腺癌預后不良[6]。本研究中比較了三陰性乳腺癌組織及非三陰性乳腺癌組織的EMT 相關蛋白的表達，統(tǒng)計結果顯示，三陰性乳腺癌組織的N-cadherin 蛋白、Vinmentin 蛋白的陽性表達率均明顯高于非三陰性乳腺癌組織，E-cadherin 蛋白的陽性表達率明顯低于非三陰性乳腺癌組織。說明三陰性乳腺癌細胞EMT 程度要高于非三陰性乳腺癌細胞。

為了進一步分析兩種亞型的乳腺癌細胞的增殖及侵襲能力，本研究采用平板克隆實驗及Transwell細胞侵襲及轉移實驗進行了相關的分析。結果顯示，三陰性乳腺癌細胞的克隆形成率及侵襲細胞數(shù)目、轉移細胞數(shù)目均明顯多于非三陰性乳腺癌細胞，證實了三陰性乳腺癌細胞的高增殖和侵襲能力，這與其高EMT 程度相關。