郭玉紅,孫忠人,孫 琦,李竹馨

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

褥瘡又稱“席瘡”“壓瘡”和“壓力性潰瘍”，多因長期臥床以及護理不當(dāng)使患者局部組織受壓所致的皮膚破潰。作為一種臨床慢性難治性疾病，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量和生命健康，加重了患者及家屬的經(jīng)濟負擔(dān)。褥瘡的愈合是動態(tài)的、互動的過程，在褥瘡愈合過程中多種細胞和生長因子參與其中，并起著重要的作用[1]。課題組研究發(fā)現(xiàn)電針傍刺能夠促進褥瘡的愈合[2]，但電針傍刺促進創(chuàng)面愈合的機制有待進一步研究。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)分布于細胞漿內(nèi)，是生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，MAPK參與了細胞的生長、發(fā)育、分化、增殖和凋亡[3]，近年來MAPK在疾病、損傷等方面的研究成為了熱點。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)作為絲裂原活化蛋白激酶家族成員，參與細胞增殖、分化和凋亡，并在這一過程中發(fā)揮著重要作用[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，在多種疾病中均發(fā)現(xiàn)了p38MAPK通路的激活，為多種疾病的發(fā)病機制及治療提供了新方向。本研究的目的是觀察電針傍刺是否通過p38MAPK通路影響創(chuàng)面修復(fù)，進一步探討電針傍刺促進瘡面修復(fù)的機制。

1 材料

1.1 實驗動物

選用健康清潔級SD雌性大鼠，共150只，體質(zhì)量220～250 g，所有實驗動物均購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號SCXK(黑)2013-001。飼養(yǎng)環(huán)境 ：在室溫20～25℃、濕度50%～60%的條件下，大鼠可以自由進食、飲水，置于單籠飼養(yǎng)。

1.2 動物分組

將150只SD雌性大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、電針傍刺組、模型抑制劑組和電針抑制劑組，共5組，其中每個組再根據(jù)1天、3天、5天、7天、9天干預(yù)時間分為5個亞組，每個亞組6只。

1.3 主要儀器及主要試劑

DM4000B顯微鏡(德國Leica);DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒);EG1160組織包埋機;HI 1220烘片機;RM2235型切片機(德國Leica);醫(yī)用微波爐(青島海爾);高速冷凍離心機(Hettich);電泳儀(美國Bio-Rad公司);制冰機(上海雪花);酶標(biāo)板(Corning);渦旋混勻器(蘇州捷美);酶標(biāo)儀(美國寶特);轉(zhuǎn)膜儀、凝膠圖像分析軟件(美國Bio-Rad公司)。SB203580(abcam,UK);石蠟、二甲苯(上海富宇);蘇木素染液(ZS-ZLI-9610);Anti-p38MAPK antibody(ab7952)(abcam，UK);SABC(兔IgG)-POD kit(SLB-SA0021);PBS緩沖液(SLB-P1010-2);BSA封閉液(SLB-SW3015);BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天);β-Actin內(nèi)參抗體(上海生工)。

2 方法

2.1 模型制備

根據(jù)缺血再灌注的原理課題組自制了大鼠壓瘡造模裝置[5]，先用尼龍扎帶在鐵絲網(wǎng)上固定住大鼠，把大鼠膝關(guān)節(jié)骨隆突處的皮膚脫毛，常規(guī)碘伏消毒，再將碘伏消毒后的裝置垂直壓在消毒后的皮膚上，裝置的壓強為100 mmHg，大鼠局部皮膚每次持續(xù)受壓2 h后，放入籠中自由活動半個小時，每日循環(huán)5次，連續(xù)造模3天。

2.2 干預(yù)方法

于造模后第2日評估褥瘡，將符合Ⅱ期褥瘡標(biāo)準(zhǔn)(2007年美國的國家壓瘡專家組建議方案)[6]的大鼠納入實驗。所有納入實驗的大鼠均于第3日行干預(yù)治療。

電針傍刺 ：用碘伏常規(guī)消毒瘡面，將一根毫針(0.17 mm×7 mm)直刺在創(chuàng)面中心，另一根毫針斜刺在創(chuàng)面的邊緣外0.5 cm處，再將微電流電刺激儀(頻率 ：0.5 Hz，電流 ：500 μA)連接在針柄上，導(dǎo)線的正極置于創(chuàng)面邊緣，負極置于創(chuàng)面的中心，持續(xù)30 min，每日1次。

各組褥瘡大鼠的創(chuàng)面均用碘伏常規(guī)消毒，模型抑制劑組腹腔注射藥量為5 mg/kg[7]的p38MAPK特異性抑制劑SB203580，于30 min后予以碘伏常規(guī)消毒；電針抑制劑組先腹腔注射SB203580，30 min后再采用電針傍刺治療；模型對照組碘伏消毒前30 min腹腔注射與SB203580等量的生理鹽水；電針傍刺組先腹腔注射生理鹽水，30 min后再行電針傍刺治療；正常對照組每日腹腔注射等量的生理鹽水，不予以其他處置。

2.3 免疫組化檢查及判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化 ：將皮膚組織標(biāo)本放入石蠟包埋，取創(chuàng)面組織小于4 μm石蠟切片，進行脫蠟、水化，3% H2O2滅活，抗原修復(fù)，PBS沖洗， BSA封閉，滴加p38MAPK一抗，4℃過夜。37℃復(fù)溫20 min，PBS沖洗，滴加二抗，37℃溫箱孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木紫復(fù)染，脫水，透明，封片。免疫組化結(jié)果分析 ：采用陽性著色細胞數(shù)計數(shù)法，取各組大鼠皮膚組織切片，在光鏡(40×10倍)視野下，p38MAPK陽性細胞呈棕黃色的細胞漿和細胞核，隨機在每張切片中選取5個不重疊視野，計數(shù)p38MAPK陽性細胞，平均數(shù)作為 p38MAPK陽性細胞數(shù)。

2.4 蛋白免疫印跡法檢查

用凝膠圖像處理系統(tǒng)將X光膠片進行灰度掃描，用ImageJ軟件測量各組目標(biāo)條帶的光密度值，再將數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2.5 統(tǒng)計分析

用SPSS17.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計量資料，方差齊的用ANOVA，多重比較用LSD檢驗，方差不齊的用秩和檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 采用免疫組化方法檢測p38MAPK在創(chuàng)面組織中的蛋白表達

在高倍鏡下 ：1天，模型對照組創(chuàng)面組織中p38MAPK陽性細胞數(shù)顯著高于正常對照組(P<0.05)，電針傍刺組P38MAPK陽性細胞數(shù)顯著高于正常對照組(P<0.05)。模型對照組創(chuàng)面組織中p38 MAPK陽性細胞數(shù)在3天時逐漸增多，在5天、7天和9天時逐漸減少；而電針傍刺組創(chuàng)面組織中p38MAPK陽性細胞數(shù)在3天、5天、7天和9天時逐漸減少。腹腔注射抑制劑SB203580后，電針抑制劑組p38MAPK陽性細胞數(shù)與電針傍刺組比較減少，模型抑制劑組p38MAPK陽性細胞數(shù)與模型對照組比較減少。見表1、圖1和封三彩圖2。

表1 各組大鼠創(chuàng)面組織中p38MAPK陽性細胞數(shù)

注:同一組內(nèi)相鄰時間比較,△P<0.05;相同時間與模型對照組比較,☆P<0.05;與電針抑制劑組比較,▲P<0.05;與模型抑制劑組比較,#P<0.05。

注 ：同一組內(nèi)相鄰時間比較,△P<0.05;相同時間與模型對照組比較,☆P<0.05;與電針抑制劑組比較,▲P<0.05;與模型抑制劑組比較,#P<0.05。圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織中p38MAPK陽性細胞數(shù)

3.2 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測各組大鼠創(chuàng)面組織中p38MAPK蛋白的表達

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,1天時，電針傍刺組p38MAPK蛋白表達與正常對照組比較顯著升高(P<0.05)，與正常對照組比較，模型對照組亦明顯升高，兩組比較有顯著性差異(P<0.05)。模型對照組p38MAPK蛋白表達在3天時逐漸升高，5天、7天、9天時逐漸下降，電針傍刺組p38MAPK蛋白表達在3天、5天、7天、9天時逐漸下降。給予抑制劑SB203580后，模型抑制劑組與模型對照組比較各干預(yù)時間點p38MAPK蛋白表達下降，電針抑制劑組與電針傍刺組比較p38MAPK蛋白表達亦下降。見表2、圖3～4。

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織中p38/β-Actin蛋白表達

注:同組相鄰時間點比較,△P<0.05;相同時間與模型對照組比較,☆P<0.05;與電針抑制劑組比較,▲P<0.05;與模型抑制劑組比較,#P<0.05。

注 ：同組相鄰時間點比較,△P<0.05;相同時間與模型對照組比較,☆P<0.05;與電針抑制劑組比較,▲P<0.05;與模型抑制劑組比較,#P<0.05。圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織中p38/β-Actin蛋白表達

注:Lane1代表正常對照組，Lane2代表模型對照組，Lane3代表電針傍刺組，Lane4代表模型抑制劑組，Lane5代表電針抑制劑組。圖4 各組p38/β-Actin蛋白表達

4 討論

褥瘡是長期臥床的患者最容易出現(xiàn)的并發(fā)癥，是目前康復(fù)治療和護理工作的難題。目前，國內(nèi)外醫(yī)護工作者正不斷探求新的更有效的治療褥瘡的方法。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)多采用外治法輔以內(nèi)治法來治療褥瘡，因針灸具有扶正祛邪、疏經(jīng)活絡(luò)、祛腐生肌的作用，許多中醫(yī)工作者采用針刺治療褥瘡取得了顯著效果[8-10]?，F(xiàn)代研究表明，電刺激能夠增強創(chuàng)面處上皮細胞和巨噬細胞的活性，促進成纖維細胞的生長及血管的形成[11]。許多臨床和實驗研究證實電刺激能夠促進皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)[12-13]。電針傍刺是利用針刺和電刺激的共同作用，在十二刺法中傍針刺的基礎(chǔ)上連接電針儀治療褥瘡的一種新的方法，體現(xiàn)了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的完美結(jié)合，將針刺與電刺激更好地應(yīng)用到褥瘡的治療中。

本實驗采用免疫組化檢測p38MAPK細胞因子，結(jié)果顯示 ：正常對照組大鼠皮膚組織中p38MAPK表達較弱，造模后褥瘡大鼠創(chuàng)面組織中p38MAPK表達增強。1天時，模型對照組和電針傍刺組創(chuàng)面組織中p38MAPK陽性細胞數(shù)明顯增多，表明p38MAPK被磷酸化而激活。電針傍刺組在3天、5天、7天和9天時p38MAPK陽性細胞數(shù)逐漸減少，p38MAPK的峰值在1天；而模型對照組在3天時p38MAPK陽性細胞數(shù)最多，在5天、7天和9天時p38MAPK陽性細胞數(shù)逐漸減少，p38MAPK的峰值在3天，說明電針傍刺促進了p38MAPK蛋白表達。給予p38MAPK特異性抑制劑SB203580后，模型抑制劑組p38MAPK陽性細胞數(shù)與模型對照組比較減少，電針抑制劑組p38MAPK陽性細胞數(shù)與電針傍刺組比較亦減少，表明SB203580通過阻斷p38MAPK通路的活化抑制了電針傍刺的治療作用。

Western Blot結(jié)果顯示,1天時，模型對照組和電針傍刺組p38MAPK蛋白表達顯著升高(P<0.05)，說明褥瘡組織中p38MAPK被激活。3天時，模型對照組p38MAPK蛋白表達逐漸升高，5天、7天和9天時p38MAPK蛋白表達逐漸下降，模型對照組p38MAPK蛋白表達峰值在3天；而電針傍刺組p38MAPK蛋白表達峰值在1天，于3天、5天、7天和9天時逐漸下降，表明電針傍刺促進了創(chuàng)面組織中p38MAPK蛋白表達。在給予SB203580后，電針抑制劑組和模型抑制劑組p38MAPK蛋白表達均下降，表明SB203580抑制了電針傍刺的治療作用。

由此可見，電針傍刺促進了p38MAPK通路中p38MAPK蛋白的表達，促進了創(chuàng)面的修復(fù)，而SB203580延長了創(chuàng)面愈合的時間，p38MAPK通路是電針傍刺促進褥瘡創(chuàng)面修復(fù)的可能作用機制之一。