劉國民 宋慶慶 林文耀

摘? 要：在豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）出現(xiàn)后的20多年，它仍然是一種對養(yǎng)豬業(yè)有重要經(jīng)濟影響的病原體。PCV2的商用疫苗在2006年首次進入美國市場，在減少感染豬的臨床癥狀和提高產(chǎn)量方面起到了顯著的作用。最近的研究表明，PCV2在豬場豬群中的流行性和敗血癥發(fā)生率有所下降。然而，新變異毒株的出現(xiàn)又使PCV2的流行性上升。本文將評論PCV2疫苗領(lǐng)域最新熱點的話題，包括比較商用疫苗的免疫效果、現(xiàn)有疫苗對新型毒株的免疫效力、自然感染和接種疫苗在免疫力上的差異、目前PCV2疫苗研究模型的局限性以及新穎試驗疫苗的研究新進展。討論也是在未來PCV2可得到凈化的前提下進行的。

關(guān)鍵詞：PCV2疫苗;免疫接種;凈化

中圖分類號：S854.5+9 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2019）10-0059-04

3? PCV2疫苗對PCV2新型毒株的免疫效力

盡管豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）疫苗能有效減少豬圓環(huán)病毒2型相關(guān)疾?。≒orcine Circovirus 2 Associated Diseases，PCVAD）的臨床癥狀，但是定期出現(xiàn)的新的PCV2毒株或PCV2毒株的變異毒株——其中一些毒株具有更強的毒力——又重新引發(fā)了人們對PCV2疫苗是否需要進行相應(yīng)的更新以能夠應(yīng)對新毒株以及PCV2疫苗在田間是否正在產(chǎn)生選擇性壓力的爭論。Ssemadaali等（2015）詳細闡述了支持這一爭論的數(shù)據(jù)，這種現(xiàn)象并不是第一次出現(xiàn)。例如，犬細小病毒疫苗能夠有效預(yù)防犬細小病毒病，但在采用該疫苗后流行毒株會定期更新。同樣，雞馬立克氏病疫苗被認為是“漏洞疫苗（leaky-vaccines）”，因為它能夠防止家禽出現(xiàn)臨床癥狀，但不能防止病毒的傳播，因此會影響未被列入疫苗構(gòu)想中的異種毒株的進化。

自PCV2在美國的豬群中流行以來，PCV2的流行株已經(jīng)發(fā)生了在兩種亞型毒株之間的轉(zhuǎn)換，第一次轉(zhuǎn)換時主要的流行毒株P(guān)CV2b于2005—2006年出現(xiàn)（Cheung等， 2007），并代替了PCV2a毒株（Reiner等， 2015; Shen等， 2012）;近年來，PCV2d毒株出現(xiàn)并在豬群中迅速流行（Xiao等， 2015），該毒株的衣殼蛋白額外增加了一個氨基酸（Guo等， 2010）。由于PCV2的所有商用疫苗都針對PCV2a亞型毒株，研究人員隨后對新出現(xiàn)的毒株進行了試驗性研究，以評估它的致病性以及當前疫苗對該毒株的免疫效力。豬在接種疫苗后病理學損傷評分下降，病毒血癥減弱，同時體內(nèi)中和抗體水平提高，由此被認為免疫產(chǎn)生了保護作用。

大多數(shù)研究表明，PCV2疫苗可以減輕由PCV2異種毒株感染引起的臨床癥狀，并且能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體反應(yīng)。然而，疫苗在減輕異種毒株引發(fā)的病毒血癥上各不相同，病毒血癥是田間試驗所面臨的最重要的挑戰(zhàn)。例如，感染PCV2b的豬接種PCV2a疫苗免疫后，PCV2b引發(fā)的病毒血癥會明顯減輕，并且在接種后（Days Post-Challenge，DPC）約100 d，攻毒株會被清除干凈。但是，利用最能夠反應(yīng)田間情況的試驗設(shè)計，并以PCV2 PCR陽性豬為試驗對象，結(jié)果顯示PCV2a疫苗并不能夠降低由已感染病毒所引起的病毒血癥，但是能夠減輕隨后由PCV2b、豬細小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Disease Syndrome Virus，PRRSV）混合感染引起的病毒血癥。實驗室研究表明，最新的PCV1-2b疫苗能夠完全清除同源PCV2b和異源PCV2a的攻毒毒株。然而，同樣在模擬田間條件（包括多重攻毒模型）的實驗室試驗中，PCV1-2b疫苗比PCV1-2a疫苗對預(yù)防PCV2b感染更有效。

在PCV2d分別于2010年和2012年出現(xiàn)于中國和美國的豬群中后，據(jù)估計，目前美國約有37%的豬群為PCV2d陽性，這一數(shù)字強有力地證明了流行的PCV2正在不斷轉(zhuǎn)變基因型。與PCV2b相似，有關(guān)PCV2d的毒性是否更強的試驗報告也是相互矛盾的。在一項研究中，Opriessnig等（2014b）利用從豬組織勻漿中分離到的非典型的PCV2和PRRSV的攻毒接種體比較了試驗用PCV2d疫苗和商用PCV2a疫苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攻毒的豬出現(xiàn)了嚴重的死亡，但存活的豬未表現(xiàn)出PCVAD癥狀。當自然感染PCV2b的豬用3種商用PCV2a疫苗免疫后再用PCV2d攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染豬的PCV2b病毒血癥和PCV2d病毒血癥都得到了減輕，但是攻毒前并沒有減輕。同樣，免疫豬的損傷評分值也顯著降低。類似的，對自然感染PCV2b和PCV2d的豬群接種商用PCV2a疫苗，感染豬的PCV2d病毒血癥減輕，同時PCV2b病毒血癥完全消失。Jeong等（2015）指出，與未免疫的豬相比，免疫豬的損傷評分值下降，平均日增重（Average Day Gain，ADG）得到提高（表1）。有趣的是，在田間試驗中，雖然平均日增重是評估疫苗免疫效果的最重要的指標，但是由于該試驗的持續(xù)時間短和環(huán)境更可控，試驗性研究所得到的數(shù)據(jù)在推斷田間情況上幾乎沒有價值。

在最近一項評估PCV2流行情況的研究中，研究人員對73家豬場的1 097頭育肥豬（2012）和27家豬場的407頭母豬采集了血清樣本并進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)育肥豬和豬場豬群的PCV2病毒血癥分別為17%和52%，而2006年相應(yīng)的PCV2病毒血癥檢測結(jié)果分別為83%和99%。這些數(shù)據(jù)表明隨著時間的推移當前的PCV2免疫接種方案可以根除豬群中的PCV2。然而，該研究并未檢測豬群中的PCV2d流行情況（Dvorak 等，2016），并且與Shen等（2012）的發(fā)現(xiàn)相反，豬場接種PCV2a疫苗的豬有較高的PCV2b病毒感染量，并且PCV2b的流行率高于PCV2a的;此外，對出現(xiàn)PCVAD臨床癥狀的豬進行組織樣本PCR檢測，結(jié)果呈PCV2b陽性或PCV2a陽性的組織分別為65%和13%，表明PCV2b是導(dǎo)致豬免疫后出現(xiàn)臨床癥狀的原因。此外，豬場的PCV2b流行性（Shen等，2012）和不斷提高的PCV2d流行性（Xiao等，2015）不能夠反映出病毒血癥完全降低的試驗數(shù)據(jù)。然而，疾病的發(fā)病率并沒有達到PCV2新毒株出現(xiàn)時疫苗接種前的水平（圖1）。因此，簡直可以說由接種PCV2a疫苗或感染PCV2a所誘發(fā)產(chǎn)生的交叉保護的基本水平能夠?qū)⑿滦投局甑挠绊憸p到最少。當現(xiàn)有的PCV2疫苗非常有效時，豬場所面臨的最大挑戰(zhàn)是豬群出現(xiàn)了高水平的病毒血癥，這會影響新的毒株或重組后變異的毒株的出現(xiàn)，以及在有協(xié)同感染因子時會影響動物的健康。Chae（2016）綜述了PCV2疫苗會影響引發(fā)呼吸道疾病綜合征的其他病原體。研究協(xié)同感染以及免疫接種中致病因子相互作用是在預(yù)防PCV2上取得進展的關(guān)鍵。

4? 評估PCV2疫苗效力的動物模型

盡管在PCV2被發(fā)現(xiàn)后的18年中科研人員在預(yù)防豬感染PCV2上的取得了顯著進展，但是第一次成功復(fù)制仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-Weaning Multi-Systemic Wasting Syndrome，PMWS）是由于培養(yǎng)物中未知有豬細小病毒存在的情況下實現(xiàn)的。盡管PMWS的臨床癥狀在協(xié)同感染模型中非常明顯，但是直到最近，PCV2疫苗的大多數(shù)研究都是在單獨用PCV2攻毒時進行的。缺乏能夠準確復(fù)制PCVAD全部癥狀的模型仍然是實驗室評估PCV2疫苗免疫效果上的主要屏障，并且要對就PCV2病毒血癥或PCV2毒力進行的實驗室研究和田間觀察之間通常觀察到的不一致結(jié)果負一定的責任。

許多因素，包括一些未充分描述特征的因素，都會影響PCVAD的癥狀，進而會影響疫苗在實驗室和田間進行的效力評估結(jié)果。一些田間變量很難在實驗室條件下被復(fù)制，所有的努力都旨在改善現(xiàn)有的動物模型。在調(diào)查研究PCVAD的過程中，豬的品種和遺傳背景的差異都被認為會在一定程度上影響動物對PCV2的敏感性。品種信息經(jīng)常會從實驗室的疫苗研究出版物中漏掉。環(huán)境條件，即溫度和飼養(yǎng)密度，同樣會對PCVAD的發(fā)展產(chǎn)生顯著影響，并且在可以對不同研究進行邏輯比較前可以保證不同研究之間的標準化。隨著我們對PCVAD的認識不斷增加，改進現(xiàn)有的動物模型將會縮短實驗室研究結(jié)果和田間數(shù)據(jù)之間的差距，并且會對PCVAD復(fù)雜的發(fā)病機理和涉及的協(xié)同病原體的相互作用有更全面的認識。

5? PCV2疫苗介導(dǎo)的免疫

盡管PCV2疫苗的臨床效力非常高，但是其保護機制尚不清楚。宿主對PCV2的免疫反應(yīng)之前已經(jīng)被廣泛討論過，中和抗體和細胞免疫（CMI）在宿主免疫應(yīng)答中都起到重要的作用。臨床得病仔豬和亞臨床感染豬之間的主要免疫學差距是中和抗體產(chǎn)生的時間延遲或低水平表達，出現(xiàn)臨床癥狀的豬會出現(xiàn)高水平的IL-10和低水平的IFN-γ應(yīng)答。了解這一發(fā)現(xiàn)的免疫學機制和分子機制對疫苗的任何合理設(shè)計都至關(guān)重要。

最近關(guān)于PCV2抗體反應(yīng)的研究已經(jīng)證實衣殼蛋白的169～180號殘留堿基位于一個可能的抗原表位上。細菌性表達單體所形成的蛋白免疫會針對169～180片段誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平抗體和低水平的中和反應(yīng)，而用在商品苗中桿狀病毒表達的蛋白免疫則不會出現(xiàn)上述情況;這表明蛋白的構(gòu)象在抗體反應(yīng)中起著重要的作用。因此可以推斷，在自然感染和免疫接種中，衣殼蛋白的蛋白水解過程的不同會針對抗原表位產(chǎn)生高水平的抗體，而在疫苗的病毒樣顆粒中抗原表位會隱藏?？梢钥隙ǖ氖牵F(xiàn)有的PCV2a疫苗和新出現(xiàn)的PCV2毒株之間會產(chǎn)生顯著的交叉保護。

據(jù)觀察，PCV2感染豬在沒有強烈的抗體反應(yīng)時不會出現(xiàn)臨床癥狀，因此可以假設(shè)細胞免疫在免疫應(yīng)答中起重要的作用但是可以被替代，并且在免疫豬和感染豬中細胞免疫有所不同。對有PMWS癥狀的免疫豬和感染豬進行比較發(fā)現(xiàn)，感染動物會產(chǎn)生有效的天然免疫，并且IL-10表達水平高，而免疫豬IFN-γ、IL-8、TNF-α和IL-1b的表達水平高。對IL-10高水平和細胞免疫的解釋為，在PCV2感染豬中程序化的死亡結(jié)構(gòu)域（程序性死亡-配體1和程序性死亡-配體2）會上調(diào)，可能會使細胞免疫減弱以及免疫抑制。衣殼蛋白而非復(fù)制酶或開放閱讀框是IL-10上調(diào)的主要原因。PCV2在豬胎兒胸腺中被發(fā)現(xiàn)要先于成熟的T細胞應(yīng)答，并且通過消除高親和力的克隆來異常調(diào)節(jié)T細胞成熟。這可能是因為PCV2衣殼被認為是自身抗原，因此可以減少抗病毒反應(yīng)的強度。

6? 新型PCV2疫苗的優(yōu)勢

隨著PCV2疫苗在提高經(jīng)濟效益和減少臨床癥狀上的成功，近年來對提升PCV2疫苗的努力聚焦在：a）提高免疫原性和疫苗有效性;b）提高不同PCV2病毒或其他協(xié)同感染病原的覆蓋率;c）開發(fā)可區(qū)分感染豬和免疫豬（Differentiation of Infected and Vaccinated Animals，DIVA）的疫苗。

在改善疫苗覆蓋率的新方法中，PCV2和PCV1基因組框架被用來表達外源表位來開發(fā)雙重、活的疫苗。例如在PCV1衣殼蛋白C段或嵌合PCV1-2感染克隆中表達PRRSV的保護表位，或者在PCV2中表達口蹄疫保護表位。隨著PCV2b代替PCV2a成為美國的流行毒株，PCV2b疫苗變?yōu)榍逗螾CV1-2b疫苗，即在PCV1的骨架中用PCV2b的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）2代替PCV1的ORF2。在實驗室研究中，新疫苗對同源和不同源的PCV2毒株均有效。為了處理豬鏈球菌病發(fā)病率的增加，一種豬痘病毒載體被用來表達豬鏈球菌的類M蛋白、PCV2的ORF2和豬IL-8，能夠成功誘導(dǎo)兩種豬病的免疫反應(yīng)。其他方法包括PCV2 ORF2在細菌鞭毛蛋白中的融合表達，可以同時提高Th1和Th2的應(yīng)答，并在DNA疫苗表達質(zhì)粒中與CpG或豬IL-8基因合并，從而提高Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

隨著PCV2疫苗的成功，全美范圍內(nèi)的根除計劃要求DIVA可用疫苗有實用性。之前已經(jīng)提到在感染克隆中將標簽插入到PCV2 ORF2的C段能夠成功表達。此外針對非結(jié)構(gòu)的ORF1蛋白來檢測抗體反應(yīng)，只在活病毒能夠復(fù)制的動物體內(nèi)表達，由此可以區(qū)分PCV2感染和免疫動物。

能夠與DIVA性能結(jié)合的可以誘導(dǎo)高水平保護的疫苗，可以進一步降低感染豬的病毒血癥，或者誘導(dǎo)產(chǎn)生消除性免疫，從而有能力解決慢性亞臨床PCV2感染的水平。

7? PCV2根除前景

在目前來看，考慮到PCV2的疫苗效力和積極的免疫實踐，最終PCV2根除的前景會成為現(xiàn)實。盡管臨床癥狀可以通過疫苗得到控制，田間面臨的最大問題是與自然流行毒株亞臨床協(xié)同感染的發(fā)生，這會加劇協(xié)同感染，減少廣泛的免疫應(yīng)答和抗病性。在積極使用PCV2疫苗的國家，PCV2的流行會隨著疫苗使用大幅度下降。同時一系列新的變異會在同一時間內(nèi)出現(xiàn)。一項在豬群中使用單苗判斷是否能夠有效根除PCV2的研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)使用疫苗會使PCV2降低到不可察覺的水平，但是當疫苗停用后病毒會在短期內(nèi)重新出現(xiàn)。因此關(guān)于單獨使用強制疫苗是否會有效根除PCV2的數(shù)據(jù)是自相矛盾的。盡管PCV2疫苗對于預(yù)防病毒感染是很有效的，但是目前不適合治療，因此想用現(xiàn)有疫苗在全美范圍內(nèi)根除PCV2是不可取的。合理設(shè)計抗PCV2感染的疫苗以及合理了解PCV2疫苗可能實現(xiàn)高水平的免疫效力和廣泛的保護力。

其次，更符合習俗的根除方法是建造無疫區(qū)，在該區(qū)域內(nèi)豬無PCV2，被強制免疫，并引入生物安全性的測量方法，之后逐漸推廣到全美。隨著PCV2發(fā)生率的降低，尋找無PCV2感染豬用作后備豬是很有可能的。盡管如此，實施這一過程中需要篩選被感染豬，這就需要找到實用的DIVA疫苗和相關(guān)的ELISA方法。想要通過單獨使用疫苗實現(xiàn)PCV2的凈化還需要更加協(xié)調(diào)、有計劃性以及更多的經(jīng)費。PCV2的凈化在相當長的時間內(nèi)將會在成本和動物健康方面帶來直接和間接的益處。

（續(xù)完）

原題名：Ten years of PCV2 vaccines and vaccination： is eradication a possibility？（英文）

原作者：Zahra Afghaha、Brett Webbb、Xiang-Jin Mengc和Sheela Ramamoorthy（美國）