楊金蘭，陳忠敏，馮麗霖，王富平

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

中藥注射劑是中藥現(xiàn)代化的重要產物，也是傳統(tǒng)醫(yī)藥理論與現(xiàn)代生產工藝相結合的產物[1]。與其他傳統(tǒng)藥物劑型相比，注射劑的生物利用度更高、起效更快、療效較好，特別是在一些危重癥患者和不能口服給藥患者的臨床治療中，發(fā)揮了重要的作用[2]。盡管國家對于中藥注射劑的提取技術沒有統(tǒng)一標準，同一產品在不同提取方式、不同批次、不同廠家獲得指紋圖譜相似性存在差異，但目前依然在臨床中應用廣泛，在許多疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用。中藥注射劑常使用增溶劑提高中藥有效成分的穩(wěn)定性、溶解性，降低刺激性等，但其臨床應用依然有限。如莪術油注射液，盡管莪術油具有抗腫瘤[3]、病原體、抗血栓、抗?jié)儭⒖乖缭械榷喾N作用[4]，但由于其處方中主要通過吐溫-80增溶[5]，吐溫-80會引起家兔紅細胞溶血和形變，且溶血率呈濃度和時間相關性增加[6]，同時有較大的刺激和過敏作用，其使用濃度和應用范圍受限[7]，導致莪術油注射液目前只被應用于消炎、抗病毒領域[8]。

為解決此問題，大量研究集中在用其他藥用輔料替代吐溫-80，如林海東在制備莪術油亞微乳注射液中，采用大豆油、精制蛋黃磷脂、油酸、伯洛沙姆(F68)為輔料，可室溫下放置6個月基本穩(wěn)定，以期避免原注射劑輔料所引起的副作用[9]。祁鳴[10]用大豆油、蛋黃卵磷脂、F68、油酸、維E、甘油為輔料，穩(wěn)定常數(shù)Ke平均最低為58.2%，加速試驗和長期留樣試驗結果顯示穩(wěn)定性良好，至少可儲存12個月，體外無明顯溶血作用，對兔耳靜脈血管無明顯不良刺激。黃尊動[11]用大豆油、中鏈油、F68、維E、甘油為輔料，30 ℃和40 ℃加速實驗6個月后，莪術油亞微乳外觀性狀不發(fā)生變化，主藥含量不下降，各項參數(shù)不發(fā)生變化，基本無局部刺激性、溶血性。由于大部分莪術油乳劑中常存在大豆油、甘油，在長期放置時游離脂肪酸和過氧化脂質含量會升高，導致保質期縮短，副作用增加[12]，為了防止脂質氧化，通常需加入抗氧劑，但增加了安全不確定性。另外，甘油會被氧化成丙烯醛而具有刺激性。為此，本研究排除大豆油、甘油，采用泊洛沙姆188(Poloxamer 188，F(xiàn)68)、海藻酸鈉(sodium alginate，SA)和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。其中，F(xiàn)68作為一種水包油乳化劑是目前用于靜脈乳劑極少數(shù)合成乳化劑之一，用F68能夠制備出粒徑小、穩(wěn)定、吸收率高的乳劑。SA可用作助乳化劑，具有藥物制劑輔料所需的穩(wěn)定性、溶解性、黏性和安全性。PEG可用作穩(wěn)定劑，能提高難溶藥物的溶解度及加強藥物在水中的穩(wěn)定性，將其用作修飾乳劑穩(wěn)定性，用3種生物相容性良好的材料替代Tween-80對莪術油的增溶作用和穩(wěn)定作用，對其市售型的莪術油亞微乳進行改性，制備一種高穩(wěn)定性、低溶血風險莪術油亞微乳，為擴大莪術油亞微乳注射液臨床應用提供基礎依據(jù)。

1 儀器與藥品試劑

1.1 儀器

D3024R臺式高速微量離心機(北京科博賽爾科技有限公司)、AR1530精密電子天平(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)、SHX150ⅡI生化培養(yǎng)箱(上海樹立儀器儀表有限公司)、PR-310酶標分析儀( 深圳市普康電子有限公司)、Bettersize2000智能激光粒度儀(中國遼寧省丹東市百特)、JRJ300-S型實驗室剪切乳化機(上海索映儀器設備有限公司)、OS20-PRO機械攪拌器(北京科博賽爾科技有限公司)、752N紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)、TU-1901紫外-可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司)、實驗室pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 藥品與試劑

莪術油(吉安市青原區(qū)綠源天然香料油提煉廠)、海藻酸鈉、香蘭素(香草醛)、濃硫酸、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(簡稱聚山梨酯-80、吐溫-80)、聚乙二醇400(PEG)(成都市科龍化工試劑廠)、泊洛沙姆188(F68)(中國阿達馬斯試劑)為市售分析純，水為注射用水。

2 方法與結果

2.1 亞微乳的制備

2.1.1莪術油亞微乳劑的制備

在攪拌條件下，將F68、Tween-80、SA、PEG依次分散于注射用水中，后將莪術油緩慢滴入進行預溶，再進行高速剪切乳化(8 000 r/min，1 h)，最后將莪術油亞微乳置于-20 ℃冷凍24 h，取出冷凍乳劑進行溶化即得。

2.1.2離心穩(wěn)定常數(shù)(Ke)的計算

乳劑因在長期靜置時穩(wěn)定性變化導致分層、絮凝、合并、破乳等。將乳劑在一定轉速下離心一段時間，可相當于自然靜置較長時間。因此，用離心分光法測定Ke是評價乳劑穩(wěn)定性常用的一種方法，Ke越小，制劑越穩(wěn)定。

取乳劑3 mL置5 mL離心試管中，4 000 r/min離心15 min后，精密量取試管底部樣品50 μL至10 mL量瓶中，用經0.22 μm微孔濾膜濾過的蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，以蒸餾水為空白，在波長500 nm處測定吸光度(A)。同法精密量取未離心乳劑樣品50 μL至10 mL量瓶中，同法測定吸光度(A0)，按式(1)計算Ke(0

Ke=(A0-A)/A×100%

(1)

2.1.3正交試驗處方優(yōu)化

以單因素實驗為基礎，取對乳劑穩(wěn)定性影響較大的輔料含量(A)、SA占輔料含量(B)、乳化劑中F68與Tween-80的比例(C)、PEG添加量(D)作為正交設計因素，以Ke為評價指標，篩選最優(yōu)處方。正交試驗設計的因素、水平安排見表1，用L25(55)正交表安排實驗，結果見表2。

表1 正交實驗安排

水平因素Aw(輔料)/%BSA占輔料的含量/%CF68:Tween-80DPEG/g10.50804∶10.0520.75703∶10.1031.00602∶10.2041.25501∶10.5051.50401∶21.00

根據(jù)表2中極差值(R)可知：各因素對亞微乳穩(wěn)定性影響主次順序是C、D、B、E、A，即乳化劑中F68與Tween-80的比例、PEG添加量、SA占輔料含量、輔料的含量的影響依次減弱。同時，通過分析正交設計表及綜合因素篩選得各因素最優(yōu)化組合為A2B2C5D5，最優(yōu)處方為輔料含量為0.75%，其中SA占輔料含量的70%，乳化劑中F68占輔料的10%，Tween-80占輔料的20%，PEG添加量為1 g。

表2 正交實驗設計

No.AB C D E Ke/%11111179.05212422266.2531333368.5741444417.0351555516.6462123437.0372234521.4782345135.4792451224.29102512357.52113135218.5112324136.85133352427.30143413579.06153524186.70164142524.73

No.AB C D E Ke/%174253130.93184314247.29194425344.92204531454.61215154331.40225215428.21235321522.25245432121.07255543279.76k149.5138.1458.2337.4150.64k235.1630.7451.4339.3747.22k343.6840.1836.8559.0741.85k440.5032.2732.7740.7832.84k536.5459.0526.1128.7532.83A2B2C5D5R14.3528.3032.1130.3217.81C>D>B>A

由于A2B2C5D5組合不在25次正交實驗中，而A3B2C4D1在25組實驗中穩(wěn)定性高,按此2組較優(yōu)處方，在固定工藝條件下制備亞微乳，平行6次，結果見表3。

表3 重復驗證實驗表

由表3可知：正交實驗優(yōu)化實驗所得的單因素最優(yōu)實驗方案A2B2C5D5的穩(wěn)定性高于正交設計實驗中最優(yōu)組A2B3C4D1。綜合單因素實驗和正交實驗最優(yōu)處方為輔料含量0.75%，其中SA占輔料含量的70%，乳化劑中F68占輔料的10%，Tween-80占輔料的20%，即莪術油∶SA∶Tween-80∶F68∶PEG=10∶21 ∶6 ∶3 ∶10。其中，本處方莪術油亞微乳中Tween-80所加含量為0.15%，占所用輔料的20%。

2.2 亞微乳乳劑粒徑大小分布測定

將最優(yōu)處方制備的莪術油亞微乳用粒度分析儀測定其粒徑大小分布，對莪術油亞微乳粒徑大小進行統(tǒng)計，評價莪術油亞微乳粒徑的均一度。結果如圖1所示，莪術油亞微乳的粒徑范圍在0.136～0.509 μm，其平均粒徑大小為0.306 μm，97%的粒徑小于0.443 μm，面積平均徑D[3，2]=0.288 μm，D(4，3)=D50=0.306 μm，顯示D(3，2)和D(4，3)結果接近，樣品顆粒的形狀規(guī)則，呈圓球型，并且粒度分布集中。

2.3 亞微乳劑含量測定

按中國藥典2010年版二部采用紫外-可見分光光度法測定莪術油的含量[15]，再以乙醇與香草醛顯色反應后為對照組，如圖2所示莪術油亞微乳、莪術油與香草醛顯色反應后在442 nm處呈最大吸收峰，空白亞微乳在此無吸收峰，說明輔料在此波長時對莪術油檢測無明顯干擾。

圖1 莪術油亞微乳粒徑分布

圖2 方法專屬性考察

配制95.3 μg/mL的莪術油乙醇溶液作為標準液，分別吸取1、0.8、0.6、0.4、0.2 mL于10 mL容量瓶中，同時用1 mL的無水乙醇為空白對照，用新配制的0.2%香草醛硫酸溶液定容，將定容好的溶液避光靜置2 h后在波長為442 nm進行分光光度法測定，記錄A值，在1.906～9.53 μg/mL莪術醇濃度范圍內，得標準曲線方程：C=108.239 6A-5.712 1,R=0.999 8(其中A吸光度，C代表濃度)。

取亞微乳樣品制成供試品溶液進行香草醛顯色，經測定A442=0.255±0.004，代入標準方程得載藥量為2.188 9±0.043 g·L-1。

2.4 亞微乳劑穩(wěn)定性驗證

2.4.1稀釋穩(wěn)定性

亞微乳劑在臨床上通常以5%的葡萄糖注射液和0.9%的NaCl生理鹽水稀釋，因此考察本品在二者中稀釋后的物理穩(wěn)定性。方法：將莪術油亞微乳劑樣品與5%葡萄糖注射液和0.9%的NaCl生理鹽水按l∶25分別配伍，室溫放置，于0、2、4、8、16和24 h后觀察外觀，測定其pH值及平均粒徑，結果如圖3、4所示，pH值無明顯變化，但在生理鹽水稀釋條件放置，乳劑粒徑變化顯著，說明用5%葡萄糖注射液稀釋所得乳劑穩(wěn)定性較好。

圖3 稀釋后pH值變化

圖4 稀釋后平均粒徑變化

2.4.2長期穩(wěn)定性

在試驗期間，分別于第3、6、9、12個月末取樣1次，對莪術油亞微乳的穩(wěn)定性常數(shù)、pH值、平均粒徑、藥物含量進行測定，結果如表4所示。在亞微乳外觀無分層漂油現(xiàn)象，為乳白色半透明色，與0月狀態(tài)比較無明顯差別，pH值、離心穩(wěn)定常數(shù)、藥物含量無明顯變化，穩(wěn)定性良好，有效期至少1年，從而驗證高速離心法可代替加速實驗完成乳劑穩(wěn)定性的檢測。

表4 長期穩(wěn)定性測定結果

時間外觀 Ke/%pH值平均粒徑/nm藥物含量/(g·L-1)RSD/%3月乳白色,半透明 5.197.153082.116月乳白色,半透明5.307.153102.089月乳白色,半透明5.557.163112.0512月乳白色,半透明5.607.183232.000.19

2.5 亞微乳體外溶血性評價

按照《中國藥典》2010年版2部附錄的紫外分光光度測定溶血率法對莪術油亞微乳進行體外溶血評價。依照表5將生理鹽水/蒸餾水/莪術油亞微乳/市售型莪術油注射液于含2%的紅細胞混懸液的試管中，充分混勻后置37 ℃生化培養(yǎng)箱中。4 h后移至離心管，1 000 r/min離心5 min，取200 μL上清液與96孔板中，設置4個復孔，用540 nm波長測定各組樣品的OD值，計算平均值，根據(jù)計算結果按照公式(2)計算溶血率[16-17]。

溶血率(%)=(Dt-Dnc)/(Dnc-Dpc)×100%

(2)

其中：Dt為實驗組莪術油亞微乳樣品的吸光值；Dnc為陰性對照組生理鹽水樣品的吸光值；Dpc為陽性對照組蒸餾水樣品的吸光值。

溶血性試驗是常用的一種檢測注射劑安全性的最基本的方法，可考查到注射劑在血液中的溶血性。通過紫外分光光度測定的溶血率法結果如圖4顯示。莪術油亞微乳溶血率隨著濃度的增加而升高，在莪術油濃度達到0.024 g·L-1后，無明顯變化，維持在1.4%左右，最大為1.47%，在試驗濃度范圍內遠遠小于安全閾值5%，符合國家標準[18]。而市售型莪術油注射液濃度大于0.024 g·L-1后溶血率出現(xiàn)劇增且超過5%，顯示市售型莪術油注射液在濃度較高時具有較大的溶血風險。

表5 溶血實驗安排

圖5 溶血率隨濃度的變化

3 討論

亞微乳作為注射劑必須具有必要的物理穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，以確保產品在貯存期安全、有效，然而亞微乳又是屬于熱力學不穩(wěn)定的一種非均相分散體系，會受到乳化劑用量，乳化時間、溫度等影響，因穩(wěn)定性改變，而在儲存過程中出現(xiàn)分層、破乳、析油等現(xiàn)象，因此亞微乳的穩(wěn)定性考察是制備亞微乳的一個重要指標。本實驗穩(wěn)定性的測定選擇離心分光法，高速離心增加了乳滴之間的碰撞幾率，可以在短時間模擬乳劑長時間存放過程中乳滴之間的碰撞、合并的結果，在一定程度上等同于長期存儲，從而提高了實驗效率。

本實驗在單因素實驗基礎上通過正交試驗篩選莪術油亞微乳制備最佳處方，制備出的亞微乳穩(wěn)定常數(shù)達到(5.42±0.47)%，且重復性高，遠遠低于已有文獻報道的莪術油亞微乳(穩(wěn)定常數(shù)Ke平均最低為58.2%)[10]，表明在相同的儲存時間內，本處方莪術油亞微乳穩(wěn)定性應更高，原因可能是由于本研究選擇SA、F68作為乳化劑和助乳化劑，讓SA與F68兩者在油水界面產生了穩(wěn)定的乳化膜，且F68可在小油滴周圍形成空間立體屏障，增加液滴表面的親水性，避免莪術油吸附在乳滴表面。F68，SA可提高乳化效果，莪術油的油水表面張力得到緩解和釋放，提高了穩(wěn)定性[21]，同時PEG可增加溶液的穩(wěn)定性作用。

本處方制備的亞微乳粒徑分布在0.136～0.509 μm之間，屬于亞微米級，粒徑分布窄且連續(xù)，顆粒的形狀規(guī)則，呈圓球型。有研究表明：亞微乳劑的穩(wěn)定性與粒徑及其分布有關，粒徑越小、粒徑分布越窄，亞微乳劑越穩(wěn)定[22]。原因可能在于本處方選擇SA作為包裹莪術油的主要成分，SA插入乳化劑F68和吐溫-80的界面膜中，形成復合凝聚膜，提高了牢固性和柔順性，促進曲率半徑很小的膜形成，增大了乳化劑的溶解度，降低界面張力，以致在高速乳化切割時，能形成粒徑大小均一乳劑。

本處方莪術油濃度為(2.188 9±0.43) g·L-1是市售型莪術油注射液(濃度為0.4 g·L-1)的5倍左右。盡管文獻[9]制備的納米乳劑粒徑為(76.5±10.1) nm，然而其濃度(1.76±0.09) g·L-1與本處方相近，低于祁鳴[10]的莪術油亞微乳濃度(10 g·L-1)，原因在于其輔料用量質量分數(shù)達到13.83%，遠高于本處方(0.75%)，輔料與莪術油的之比達到13.83∶1，而本處方此比例僅為3∶1，單位質量輔料包裹莪術油量更大。

本處方用F68/SA/PEG替換80%的吐溫-80以后，在試驗條件下顯著降低了由吐溫-80引起的溶血率急劇增加的風險，且即使繼續(xù)提高濃度，溶血風險也能控制在安全范圍內。這可能與處方中的具有良好血液相容性的SA、F68、PEG對含量較少的吐溫-80起到了遮蔽作用有關，使其無法大量接觸紅細胞，還有可能在亞微乳乳滴表面被柔順而親水的PEG鏈覆蓋，提高亞微乳膜的親水性，降低表面自由能，使表面自由能降低到接近血管內膜的表面自由能值，降低溶血風險。正常人體血管壁內皮細胞的電位值為負，血液中的紅細胞、白細胞及血小板等均帶負電荷，因此不易發(fā)生粘附[23]。SA在水溶液中可表現(xiàn)出聚陰離子行為，使亞微乳膜表面帶負電，從而減少血栓的形成，提高了血液相容性。

4 結束語

本研究篩選制備莪術油亞微乳的最佳處方具有較高的穩(wěn)定性和載藥量。本處方莪術油亞微乳從穩(wěn)定性、pH值、粒徑、溶血性方面符合國家中藥亞微乳注射液的標準要求，且在較高濃度下風險可控，為擴大其在臨床應用提供基礎依據(jù)，同時也可為其他中藥注射液的制備提供參考。