曾凡鵬，胡 光，羅麗梅，吳翔宇，鄭一敏

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

川芎嗪(ligustrazine,Lig)是從藥材川芎(RhizomaChuanxiong)中分離提純出的生物堿單體[1]。川芎嗪具有抑制血管平滑肌痙攣、改善心肌缺血、抑制血小板聚集、改善血液流變性[2-5]及抗自由基等特點(diǎn)，作為天然活性成分在藥物設(shè)計(jì)合成中被廣泛應(yīng)用[6-10]，臨床上主要用于缺血性心腦血管疾病的治療[11-13]。現(xiàn)有臨床上治療心腦血管疾病藥物，往往會(huì)造成出血副作用大、耐藥、代謝快等缺點(diǎn)[14-15]。

陳鴻飛等[16]報(bào)道川芎嗪衍生物合成條件為K2CO3堿性環(huán)境，60 ℃、6 h，使用甲苯進(jìn)行減壓蒸餾除去DMF，乙酸乙酯與水進(jìn)行萃取分離有機(jī)相，產(chǎn)率為60%左右，同時(shí)在中間體的制備過程中使用二氯亞砜鹵代反應(yīng)，該方法反應(yīng)劇烈且試劑較刺激，但未見文獻(xiàn)報(bào)川芎嗪氨類衍生物抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)。

本研究以川芎嗪為先導(dǎo)化合物，采用溴代鹵化法制備中間體，使用NaH作為堿性環(huán)境，后處理不需要進(jìn)行過濾除去固體K2CO3，同時(shí)加入了相轉(zhuǎn)移催化劑。通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選最佳的溫度、時(shí)間以及原料配比，再采用正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，產(chǎn)率提高了20%左右，并對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物采用質(zhì)譜和核磁結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)，隨后進(jìn)行了抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)報(bào)道如下。

1 試驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器：核磁(NMR)-600 MHz測(cè)定(CDCl3，TMS為內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker公司)；ZF-I型三用紫外分析儀(藍(lán)尼詩(shī)爾商貿(mào)有限公司)；Finnigan-LCQDECA (ESI-MS)(美國(guó)熱電公司)；PSL-1810型磁力攪拌低溫槽(EYELA東京理化器械株式會(huì)社)。

試劑：無(wú)水三乙胺、K2CO3、N,N-二甲基酰胺、(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇(阿達(dá)瑪斯試劑公司)。

1.2 合成方法

以三溴化磷和(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇為原料，以四氫呋喃為溶劑，反應(yīng)得到2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪，再與化合物對(duì)氨基苯甲酸甲酯化合物經(jīng)過親核取代反應(yīng)得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸甲酯川芎嗪氨類衍生物，最后經(jīng)過水解得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3d)，川芎嗪氨類衍生物合成路線如圖1所示。

圖1 川芎嗪氨類衍生物合成路線

1.2.12-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪中間體的制備

在氬氣保護(hù)、無(wú)水條件下，將雙頸圓底燒瓶置于低溫反應(yīng)器中冷至-5 ℃，加入5.0 mmol PBr3冷卻并攪拌5 min，再加入無(wú)水三乙胺0.34 mL繼續(xù)攪拌2～3 min，再稱取15.2 mmol(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇溶于20 mL 四氫呋喃溶液中，用滴液漏斗緩慢滴加到雙頸圓底燒瓶中，待滴加結(jié)束后，將反應(yīng)裝置轉(zhuǎn)移至室溫反應(yīng)8 h，TLC板檢測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后真空旋除殘留溶劑，殘留物加冰水進(jìn)行淬滅，并用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥，真空旋除溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)行分離純化，最后得到2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪。

1.2.24-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸的合成

在氬氣保護(hù)、無(wú)水條件下，將雙頸圓底燒瓶置于低溫反應(yīng)器中冷卻至-5 ℃，稱取200 mgNaH置于25 mL的雙頸圓底燒瓶中，再加入一定量對(duì)氨基苯酯類化合物，再稱取2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪531.6 mg，相轉(zhuǎn)移催化劑四丁基碘化銨0.05 g，最后量取15 mL N,N-二甲基酰胺溶劑加入雙頸圓底燒瓶中。反應(yīng)溫度85 ℃、8 h得到目標(biāo)產(chǎn)物，硅膠柱分離純化得到4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3d)川芎嗪衍生物。

1.2.3結(jié)構(gòu)確認(rèn)

m.p.131-133℃.1H NMR (MeOD,150 MHz)δ=6.73(s,1H,Ar-H),7.81(s,1H,Ar-H),6.75(s,1H,Ar-H),7.82(s,1H,Ar-H),2.56(s,3H,CH3),2.55(s,3H,CH3),2.52(s,3H,CH3),4.46(s,2H,CH3).13C NMR (MeOD,600 MHz)δ=152.53,151.81,151.81,149.63,148.66,148.27,147.40,131.31,131.21,118.14,112.20,45.47,19.82,19.66,18.69.川芎嗪衍生物3d結(jié)構(gòu)譜圖1H NMR(見圖2)和13C NMR(見圖3)。

圖2 化合物3 d的13C NMR

圖3 化合物3d的1H NMR

1.3 抗血小板聚集試驗(yàn)方法

將制備好的富血小板血漿放在搖床里37 ℃溫育20 min，用移液槍吸取180 μL溫育好的PRP加入96孔板中，加樣時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，如果有氣泡用加熱的針頭扎破。再加入10 μL待測(cè)藥品，終濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL，37 ℃溫育振搖5 min，將酶標(biāo)儀設(shè)置為震動(dòng)1次時(shí)間為10 s，波長(zhǎng)為570 nm。將96孔板置于酶標(biāo)儀上快速震搖10 s測(cè)定吸光度，每30 s測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)3次，記各孔3次吸光度均值為A0。之后加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(ADP)終濃度為5 μmol/L，繼續(xù)每30 s測(cè)定一次吸光度直至吸光度不再變化，記平行孔的吸光度均值為A，阿司匹林為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 工藝優(yōu)化

本工藝主要對(duì)第2步2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪與對(duì)氨基苯甲酸甲酯化合物反應(yīng)合成的川芎嗪氨類衍生物進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，以考察反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1反應(yīng)溶劑的考察

反應(yīng)溶劑對(duì)收率的影響考察結(jié)果見表1。

表1 反應(yīng)溶劑對(duì)收率的影響

由表1可知：乙腈、四氫呋喃沸點(diǎn)較低，不能滿足實(shí)驗(yàn)要求的溫度。使用甲苯產(chǎn)率也相對(duì)較低，為60%。選擇DMF作為溶劑，產(chǎn)率可高達(dá)91%。

2.1.2反應(yīng)時(shí)間的考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪為定量，選擇DMF為溶劑，改變反應(yīng)時(shí)間，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)收率的影響，結(jié)果見表2。

表2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)收率的影響

由表2可知：隨時(shí)間延長(zhǎng)，反應(yīng)產(chǎn)率不斷變大，8 h反應(yīng)進(jìn)入高峰期，11 h收率下降。

2.1.3原料配比考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪為定量，改變對(duì)氨基苯酯類化合物的量，考察了原料配比對(duì)收率的影響，結(jié)果見表3。

表3 反應(yīng)原料配比對(duì)收率的影響

由表3可知：反應(yīng)原料配比為1∶0.8時(shí)，收率可達(dá)72%；增加對(duì)氨基苯酯化合物的量，收率變大，當(dāng)配比為1∶1.2時(shí)收率最大，繼續(xù)增加對(duì)氨基苯酯化合物的量，收率變小。

2.1.4反應(yīng)環(huán)境考察

以1 mmol 2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪為定量，考察了反應(yīng)環(huán)境堿性的強(qiáng)弱對(duì)收率的影響，結(jié)果見表4。

表4 反應(yīng)環(huán)境對(duì)收率的影響

由表4可知：堿性強(qiáng)弱對(duì)反應(yīng)的收率有較高的影響。K2CO3的收率為52%。強(qiáng)堿NaH的收率高達(dá)89%。

2.1.5反應(yīng)溫度考察

由表5可知：溫度對(duì)反應(yīng)的收率有較高的影響。65 ℃時(shí)的收率為68%，85 ℃時(shí)的收率高達(dá)88%。

表5 反應(yīng)溫度對(duì)收率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素考察預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇反應(yīng)時(shí)間(A)、反應(yīng)配比(B)、反應(yīng)溫度(C)3個(gè)因素為考察因素，截取各因素3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素及水平見表6，正交試驗(yàn)見表7，方差分析結(jié)果見表8。

表6 因素水平

水平A(反應(yīng)時(shí)間/h)B(反應(yīng)溫度/℃)C(反應(yīng)配比)14651∶128851∶1.23121001∶1.4

表7 正交實(shí)驗(yàn)L9(34)結(jié)果分析

表8 方差分析

從表7正交實(shí)驗(yàn)L9(34)結(jié)果分析得出：最優(yōu)的組合為A2B2C3，即反應(yīng)時(shí)間為8 h，反應(yīng)配比為1∶1.2，反應(yīng)溫度為85 ℃時(shí)產(chǎn)率最高。從表8方差分析可以看出：反應(yīng)時(shí)間(A)、反應(yīng)溫度(B)對(duì)產(chǎn)率有顯著的影響(P<0.05)，而反應(yīng)配比(C)對(duì)產(chǎn)率影響相對(duì)不大。

2.3 實(shí)驗(yàn)活性評(píng)價(jià)

通過正交試驗(yàn)篩選的最佳合成路線得到的4-((3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基)氨基)苯甲酸(3 d)，其抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)活性要好于陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林IC50=37.38<42.96，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見表9、10。

表9 阿司匹林對(duì)血小板聚集的影響

表10 阿司匹林對(duì)血小板聚集的影響

3 討論

根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)獲得的合成目標(biāo)產(chǎn)物收率，確定了本工藝合成的最佳實(shí)驗(yàn)條件：反應(yīng)溶劑為DMF、反應(yīng)時(shí)間為8 h、反應(yīng)配比為1∶1.2、堿性環(huán)境為NaH、反應(yīng)溫度為85 ℃。

本工藝方法比傳統(tǒng)方法收率更高，反應(yīng)過程檢測(cè)及后處理變得簡(jiǎn)單，同時(shí)原料易獲得。得到的川芎嗪衍生物的收率高達(dá)88%，比文獻(xiàn)報(bào)道的合成方法得到的產(chǎn)物收率提高了20%，實(shí)驗(yàn)后處理不需要過濾分離，更節(jié)省時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)采用三溴化磷作為鹵化反應(yīng)的親和試劑，而氯化亞砜有刺激性臭味反應(yīng)劇烈，在使用氯化亞砜的過程中會(huì)生成大量HCl和SO2，對(duì)環(huán)境造成污染，同時(shí)氯化亞砜易發(fā)生水解反應(yīng)，造成產(chǎn)率下降。因此，本合成工藝對(duì)環(huán)境污染很小。

抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本研究合成的川芎嗪衍生物具有抗血小板聚集作用且效果好于陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林。本研究合成的川芎嗪衍生物羧基在15位碳原子上，16位和17位羧基取代活性還需進(jìn)一步研究；同時(shí)，血小板在制備的過程中，抗凝劑會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)分析產(chǎn)生誤差，防止血凝的方法還需要改進(jìn)。