徐君　李欣　江君　王歡　姜紅衛(wèi)

摘要：采用表型性狀和簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（ISSR）標(biāo)記，對(duì)36個(gè)碗蓮品種（系）進(jìn)行遺傳多樣性分析?；?3個(gè)表型性狀，品系間歐氏遺傳距離系數(shù)平均值為7.78，范圍在3.54～15.78間，聚類分析顯示，以歐氏距離系數(shù)E=11.0，可將所有材料分為4組，其中32個(gè)聚在一個(gè)類群?；?0個(gè)ISSR引物，36個(gè)品系共獲得62條擴(kuò)增帶，其中44條具有多態(tài)性，多態(tài)帶百分率為 71.0%，品系間的遺傳相似性系數(shù)平均值為0.40，范圍在0.10～0.71間，以遺傳相似系數(shù)GS=0.60，可將所有材料分為3組。ISSR標(biāo)記分析與表型性狀分析都說明，碗蓮資源遺傳背景狹窄，互相間親緣關(guān)系比較接近。

關(guān)鍵詞：碗蓮;表型;ISSR;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S682.320.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）19-0137-05

收稿日期：2018-05-24

基金項(xiàng)目：江蘇省林業(yè)科技創(chuàng)新與推廣項(xiàng)目（編號(hào)：LYKJ[2017]09）;江蘇省蘇州市科技計(jì)劃（編號(hào)：SNG201508）。

作者簡介：徐 君（1982—），男，江蘇蘇州人，碩士，副研究員，主要從事水生花卉分子生物學(xué)研究。E-mail：flyforever007@hotmail.com。

通信作者：姜紅衛(wèi)，碩士，副研究員，主要從事觀賞植物育種與栽培研究。E-mail：sanjwh@163.com。

荷花（Nelumbo nucifera）是我國十大傳統(tǒng)名花之一，深受人們喜愛。小株型荷花品種一般指碗蓮，指在口徑為26 cm以內(nèi)盆器中可正常生長、開花的一類微型荷花，是人們?yōu)榱藵M足在庭院、廳堂、臥室賞荷的需要而逐步培育出來的[1]。碗蓮以亞洲蓮為主，其變異主要局限于有限的幾個(gè)表型性狀，雖然品系較多，但遺傳背景并不豐富，且許多觀賞性狀差異并不一定是遺傳物質(zhì)本身存在差異，可能是基因表達(dá)差異形成的。因此，系統(tǒng)地研究碗蓮品系間的遺傳多樣性，能夠有效減少下一步育種工作中親本選配的盲目性，提高目標(biāo)性和預(yù)見性。此外，碗蓮是荷花的高級(jí)進(jìn)化種，其變異性、遺傳多樣性研究在荷花進(jìn)化、品種分類等方面也有重要的意義[2]。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的日益發(fā)展，其已經(jīng)成為研究物種遺傳多樣性的重要手段。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（ISSR）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）等技術(shù)都已被應(yīng)用于蓮遺傳多樣性研究[3-5]。Li等利用RAPD和ISSR標(biāo)記對(duì)70份中國蓮、7份泰國蓮和2份美洲黃蓮種質(zhì)進(jìn)行了遺傳變異檢測，發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)分別達(dá)到了91.20%（ISSR）和 96.40%（RAPD）[6]。而Fu等利用AFLP標(biāo)記對(duì)蓮的138份主要栽培品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)百分率僅為28.7%[7]。試驗(yàn)材料的差異、分子標(biāo)記技術(shù)的不同，導(dǎo)致蓮品種資源遺傳多樣性分析結(jié)果會(huì)產(chǎn)生比較大的差異。針對(duì)碗蓮的遺傳基礎(chǔ)研究中，孔德政等采用RAPD標(biāo)記對(duì)8個(gè)碗蓮品種進(jìn)行了遺傳分析，并為8個(gè)品種分別建立了指紋圖譜[2];管志濤等對(duì)23個(gè)碗蓮品種的形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)最長距離法是一種非常有效的碗蓮品種分類的聚類方法[8]。目前碗蓮品種多樣性研究與應(yīng)用仍處于探索階段。本研究以表型性狀為基礎(chǔ)，在前期構(gòu)建荷花ISSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上[9]，系統(tǒng)地進(jìn)行表型性狀、ISSR標(biāo)記的遺傳多樣性研究，旨在深入揭示碗蓮各品系間遺傳多樣性差異，為進(jìn)一步充分發(fā)掘現(xiàn)有資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的碗蓮資源材料36份，取自蘇州市荷塘月色濕地公園蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院荷花資源保存圃。編號(hào)、品種名稱、種源等信息見表1。

1.2 表型性狀調(diào)查

表型性狀調(diào)查所用36個(gè)供試品種（系）于2016年3月統(tǒng)一種植于蘇州市荷塘月色濕地公園蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院荷花資源保存圃。采用標(biāo)準(zhǔn)資源保存池，每個(gè)品種種植1池，每池4支種藕，田間管理按常規(guī)方法統(tǒng)一進(jìn)行。性狀調(diào)查于7月下旬至10月上旬進(jìn)行，每個(gè)性狀調(diào)查（測量）4個(gè)樣品（數(shù)據(jù)），調(diào)查方法參照《荷花新品種記載項(xiàng)目》記載標(biāo)準(zhǔn)[10]，共記錄數(shù)量性狀9個(gè)（最長葉徑、最短葉徑、立葉高、花柄高、花瓣數(shù)、最長花徑、花瓣縱徑、花瓣橫徑、心皮），質(zhì)量性狀14個(gè)（株型、初花期、群體花期、著花密度、花香、花蕾型、花型、花態(tài)、花瓣尖色、花中色、花基色、雄蕊瓣化、雌蕊成熟形態(tài)、青熟花托），質(zhì)量性狀變異及編碼見表2。

1.3 基因組DNA的提取與ISSR-PCR反應(yīng)

荷花基因組DNA的提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法。PCR反應(yīng)體系及程序參照荷花ISSR-PCR優(yōu)化體系[8]，ISSR引物的篩選以哥倫比亞大學(xué)于2006年公布的100個(gè)引物序列為基礎(chǔ)，選擇條帶多態(tài)性、穩(wěn)定性較好的10個(gè)引物。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外光下用UV凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有表型性狀數(shù)據(jù)采用DPS 7.05軟件處理，質(zhì)量性狀通過群落多樣性指數(shù)命令計(jì)算分布頻率及多樣性指數(shù)（H′），數(shù)量性狀通過基本參數(shù)估計(jì)命令統(tǒng)計(jì)最小值、最大值、變異幅度、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)。ISSR-PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)選擇凝膠電泳結(jié)果中的清晰的譜帶，擴(kuò)增產(chǎn)物在相同遷移位置有帶賦值1，無帶賦值0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)各引物總擴(kuò)增帶（amplified bands，簡稱AB）、多態(tài)帶（polymorphic bands，簡稱PB）、多態(tài)帶百分率（percentage of polymorphic bands，簡稱PPB）。聚類分析利用統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS 7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。表型數(shù)據(jù)分析采用數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、歐式距離系數(shù)（E）法計(jì)算，聚類方法則采用最長距離法。ISSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，采用Jaccard遺傳相似系數(shù)，聚類方法同樣按最長距離法。記錄36個(gè)碗蓮品種（系）相互之間的歐氏遺傳距離及Jaccard遺傳相似系數(shù)（GS）（各630個(gè)值），統(tǒng)計(jì)其在不同數(shù)值范圍內(nèi)出現(xiàn)的頻次。

2 結(jié)果與分析

2.1 碗蓮基于表型性狀的遺傳多樣性分析

2.1.1 質(zhì)量性狀的變異及遺傳多樣性

14個(gè)質(zhì)量性狀的統(tǒng)計(jì)分析（表3）表明，參試36個(gè)碗蓮品種（系）中，未有花態(tài)為碟狀及球狀的資源，未有花瓣尖部及中部為黃綠色、花基部色為紅色的資源，其余各性狀在其描述級(jí)別上基本都有分布，但極不均勻。碗蓮為小型荷花，株型絕大多數(shù)為中、小型，以中型為多;群體花（周）期有長、短2種表型，參試品種中僅玉繡球?yàn)槎袒ㄆ?，其余表型均為長花期;著花密度有3種表型，以密度為密所占比例較高;花香有3種表型，以香度適中所占比例較高;花態(tài)有3種表型，以碗狀所占比例較高;花瓣尖色、花中色各有4種表型，以紅色所占比例較高;雌蕊成熟形態(tài)有3種表型，以結(jié)實(shí)所占比例較高;青熟花托有3種表型，以斗形所占比例較高。以上9個(gè)質(zhì)量性狀中占比高的表型分布頻率均高于60%，表現(xiàn)出較高的集中性，其多樣性指數(shù)相對(duì)較低。初花期、花蕾型、花型、花基色、雄蕊瓣化程度5個(gè)性狀頻率分布較平均，其多樣性指數(shù)較高。

2.1.2 數(shù)量性狀的變異及遺傳多樣性

數(shù)量性狀的統(tǒng)計(jì)分析（表4）表明，36個(gè)碗蓮品種（系）數(shù)值型性狀差異較大，9個(gè)數(shù)值性狀的變異系數(shù)在15.6%～77.7%間，平均為336%。少瓣型和重臺(tái)型荷花花瓣數(shù)差異較大， 因此性狀花瓣數(shù)變異系數(shù)達(dá)到77.7%。立葉高、花柄高的變異系數(shù)超過了40%，最大葉莖、最小葉莖、花莖、花瓣縱莖、花瓣橫莖等性狀的變異系數(shù)也都在20%左右。本研究所記錄的數(shù)量性狀多數(shù)是與株型大小有關(guān)的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，碗蓮種質(zhì)資源數(shù)值型性狀的變化幅度和變異系數(shù)均較大，不同品系株型之間有明顯差異。

2.1.3 表型性狀的遺傳距離及聚類分析

由圖1、圖2可知，基于23個(gè)表型性狀，36個(gè)碗蓮品種（系）間歐氏距離系數(shù)平均值為7.78，變幅為3.54～15.78。所有材料中，以唐婉和紅日間的歐氏距離系數(shù)最小，為3.54，2個(gè)材料均由中國荷花研究中心育成，株型、花型、花態(tài)等性狀均一致，區(qū)別僅在于紅日為紅蓮型，唐婉則為花瓣尖紅的粉蓮型;小碧玉和白萬萬間的歐氏距離系數(shù)最大，為15.78，小碧玉為所有材料中株型最小的，白萬萬則為所有材料中株型最大的。以距離1.6為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)36個(gè)碗蓮品種（系）630個(gè)兩兩間距離系數(shù)在10個(gè)范圍內(nèi)的出現(xiàn)頻度，DPS 7.05基本參數(shù)正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，系數(shù)頻度呈正態(tài)分布，頻度峰值出現(xiàn)在系數(shù)6.4～8.0之間，共有220個(gè)。36個(gè)品種（系）間按最長距離法聚類，以系數(shù)E=11.00，可將所有材料分為4組，第1類群包含36個(gè)材料中的32個(gè)，小碧玉、新水蜜桃、白萬萬、玉繡球分類較遠(yuǎn)。第1類群以系數(shù)E=9.45，可再分為3類，各組間花瓣平均數(shù)差距較大，為重要的分類性狀。

2.2 碗蓮基于ISSR分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析

2.2.1 ISSR標(biāo)記多態(tài)性

由表5可知，用所篩選的10個(gè)ISSR引物，對(duì)36個(gè)荷花品種（系）進(jìn)行擴(kuò)增，共產(chǎn)生62條大小在150～1 600 bp間的條帶，其中44條具有多態(tài)性，多態(tài)百分率為71.0%。引物UBC895擴(kuò)增出的清晰條帶最多，為11條;引物UBC846的擴(kuò)增條帶數(shù)最少，僅有2條。所有引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性比率均高于40%，引物UBC840、UBC848擴(kuò)增條帶的多態(tài)性比率最高，為100%?？傮w上，10個(gè)ISSR標(biāo)記在碗蓮基因組中能揭示較多的信息量。

2.2.2 ISSR標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)及聚類分析

由圖1、圖2可知，以36個(gè)碗蓮品種和62個(gè)位點(diǎn)的譜帶數(shù)據(jù)為原始矩陣，共獲得630個(gè)兩兩不同品種間的遺傳相似系數(shù)，系數(shù)平均值為0.40，變幅為0.10～0.71，所有材料中，以千堆錦和一捧雪之間的遺傳距離系數(shù)最小，為0.10，白佛手與玉繡球間的遺傳距離系數(shù)最大，為0.71。以系數(shù)0.1為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)36個(gè)碗蓮品種（系）630個(gè)兩兩間距離系數(shù)在10個(gè)范圍內(nèi)出現(xiàn)的頻度，DPS 7.05基本參數(shù)正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，系數(shù)頻度呈偏態(tài)分布，說明大部分資源遺傳距離比較接近，峰值出現(xiàn)在系數(shù)為0.3～0.4之間，共有219個(gè)。以0.60為閾值可以把36個(gè)碗蓮品種分為3組。

3 討論與結(jié)論

表型標(biāo)記和分子標(biāo)記是最常用的遺傳多樣性分析方法，分子標(biāo)記體現(xiàn)的是材料間DNA水平的變異，具有取樣較少、試驗(yàn)簡單、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，但試驗(yàn)表明，不同的標(biāo)記、不同的反應(yīng)引物甚至不同的反應(yīng)條件都會(huì)引起結(jié)果的誤差[12]。表型分析記錄的數(shù)據(jù)較為直觀，是種質(zhì)資源研究中的基礎(chǔ)，但由于表型是基因與環(huán)境互作表達(dá)的結(jié)果，性狀的表達(dá)易受環(huán)境影響。徐福榮等通過對(duì)表型性狀和SSR標(biāo)記的比較，認(rèn)為SSR標(biāo)記在鑒定云南省水稻主要品系的工作中更為可靠[13]，而石勝友等通過表型性狀與AFLP標(biāo)記的比較，認(rèn)為積累相關(guān)表型性指標(biāo)是分子生物學(xué)技術(shù)在芒果遺傳育種工作中進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)[14]。2種分析方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在資源遺傳多樣性研究工作中，可結(jié)合使用，以達(dá)到更好的效果。

本研究利用表型性狀和ISSR標(biāo)記研究了36份碗蓮資源的遺傳多樣性。所采集的23個(gè)表型性狀，主要是基于《荷花新品種記載項(xiàng)目》記錄的碗蓮花、葉、株型等性狀，其中有19個(gè)性狀與花有關(guān)，涵蓋了花色、花型、高度、大小、生理期等各方面，較為全面地反映了碗蓮花的特征，這些性狀在實(shí)際工作中便于觀察和獲取，且均屬于穩(wěn)定性狀，是新品種登記項(xiàng)目中利用的主要數(shù)據(jù)，因此這些數(shù)據(jù)能夠較好地展現(xiàn)觀賞碗蓮花性狀的遺傳多樣性。分析結(jié)果顯示，雖然碗蓮資源各性狀在描述級(jí)別上大部分都有分布，但分布極不均勻，尤其是作為觀賞花卉比較重要的花色、花態(tài)等幾個(gè)指標(biāo)，如參試的碗蓮資源中69.4%為紅花蓮品種，黃蓮品種僅有金玉滿堂1個(gè)，而花態(tài)為碗狀的資源占總體的80.5%，沒有花態(tài)為碟狀和球狀的資源。除玉繡球、小碧玉、新水蜜桃、白萬萬等個(gè)別品系，各資源間歐式遺傳距離較為接近。碗蓮資源ISSR標(biāo)記顯示，雖然多態(tài)帶的比例達(dá)到71.0%，但除新水蜜桃、白萬萬、金陵女神等個(gè)別品系，各資源間遺傳相似系數(shù)較為接近，品系間遺傳相似系數(shù)主要分布在0.3～0.4間。表型數(shù)據(jù)分析顯示，各資源間歐氏遺傳距離頻數(shù)呈正態(tài)分布，而根據(jù)ISSR標(biāo)記數(shù)據(jù)分析可知，各資源間遺傳相似系數(shù)呈偏態(tài)分布，說明ISSR標(biāo)記分析碗蓮資源相互間遺傳距離結(jié)果比表型標(biāo)記分析所得結(jié)果要更接近。表型鑒定和ISSR標(biāo)記結(jié)果都說明，碗蓮品種遺傳背景較為狹窄，互相間親緣關(guān)系比較接近，分析原因，可能是由于大部分品系是從幾個(gè)主要材料雜交選育而來的。

碗蓮是荷花的高級(jí)進(jìn)化種，近年來，隨著育種工作者的辛勤工作，包括碗蓮在內(nèi)的荷花新品種不斷涌現(xiàn)[15]。但從遺傳多樣性角度而言，碗蓮的遺傳背景仍相對(duì)狹窄，可根據(jù)多樣性鑒定結(jié)果，有針對(duì)地引進(jìn)黃蓮資源、花態(tài)為碟狀及球狀、相對(duì)株型較大的資源，通過進(jìn)一步的雜交選育，豐富碗蓮資源的遺傳多樣性。

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