曹丁　李學(xué)優(yōu)　昝繼清　蘭玲峰　甘祥武

摘要：旨在利用畢赤酵母密碼子的偏好性和遺傳簡(jiǎn)并性，將雞α干擾素優(yōu)化基因片段cIFN-α[STBX]2[STBZ]連入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k，再經(jīng)重疊延伸PCR方法去除重組質(zhì)粒的5′端非翻譯區(qū)多余的8個(gè)核苷酸GGATCCAA，使其與畢赤酵母AOX1（醇氧化酶）的5′端非翻譯區(qū)的序列完全一致，構(gòu)建并篩選重組畢赤酵母，并進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)。將表達(dá)產(chǎn)物用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行檢測(cè)，并用微量病變抑制法檢測(cè)其抗病毒效價(jià)?？共《净钚詸z測(cè)結(jié)果顯示，天然基因、優(yōu)化基因、質(zhì)粒5′端非翻譯區(qū)改造后的優(yōu)化基因重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒效價(jià)分別為105、106、1.5×106 U/mL。雞α干擾素基因優(yōu)化后的抗病毒效價(jià)提高了10倍，對(duì)質(zhì)粒5′端非翻譯區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步改造后，表達(dá)蛋白的抗病毒活性提高了50%，從而為雞α干擾素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞α干擾素;真核表達(dá);pPIC9k;分泌表達(dá);抗病毒活性

中圖分類號(hào)： Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）19-0068-04

收稿日期：2018-09-16

基金項(xiàng)目：廣州市科技計(jì)劃（編號(hào)：201610010087）。

作者簡(jiǎn)介：曹 ?。?986—），女，河南南陽人，碩士，高級(jí)工程師，主要從事生物農(nóng)業(yè)工程方面的研究。E-mail：caoding218@163.com。

干擾素是一類能夠誘導(dǎo)人及動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的類激素蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性，可有效解決禽類的疫病泛濫問題，并能夠解決應(yīng)用抗生素造成的菌群失調(diào)、出現(xiàn)耐藥性菌株及藥物的不良反應(yīng)等問題[1-2]。畢赤酵母是近年來發(fā)展起來的一種以甲醇為碳源的真核表達(dá)系統(tǒng)，酵母可對(duì)異源蛋白進(jìn)行修飾，采用有信號(hào)肽的質(zhì)粒時(shí)，蛋白能被正確折疊和加工，然后被分泌到培養(yǎng)基中。畢赤酵母分泌蛋白除了具有與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白許多相似的優(yōu)點(diǎn)外，還具有操作簡(jiǎn)便、營(yíng)養(yǎng)要求低、培養(yǎng)價(jià)格低廉、便于高密度發(fā)酵、高產(chǎn)分泌表達(dá)外源蛋白以及表達(dá)產(chǎn)物易于純化等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。因此，基于畢赤酵母的表達(dá)系統(tǒng)，可以有效地高表達(dá)重組雞α干擾素。

雞α干擾素作為禽類干擾素中的代表，其抗病毒作用較強(qiáng)。本研究為了解決天然雞α干擾素基因表達(dá)量低下等問題，在其成熟肽序列的基礎(chǔ)上，選用畢赤酵母偏好性密碼子，人工合成其優(yōu)化基因序列，并在基因序列前加入蛋白酶切割位點(diǎn)，使其表達(dá)蛋白具有天然的N端。此外，將連入的真核表達(dá)載體pPIC9k的5′端非翻譯區(qū)（5′UTR）序列進(jìn)行改造，去除多余的8個(gè)堿基序列，使其與畢赤酵母AOX1（醇氧化酶）的mRNA序列完全一致，并初步研究了改造載體在畢赤酵母SMD1168中的表達(dá)和抗病毒活性，以期提高雞α干擾素的表達(dá)水平，解決其在工業(yè)生產(chǎn)中的瓶頸問題。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和質(zhì)粒

pPIC9k質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、畢赤酵母SMD1168和水泡性口炎病毒（VSV），均由廣東省微生物種質(zhì)資源庫(kù)保存。

1.2 主要試劑

PFU（高保真DNA聚合酶） Mix、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、引物、核酸染色劑、瓊脂糖，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、G418、DNA marker、蛋白質(zhì)marker，購(gòu)自TaKaRa公司;酵母抽提物、胰蛋白胨，購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司;瓊脂粉，購(gòu)自廣州環(huán)凱生物科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備

主要儀器與設(shè)備有生化培養(yǎng)箱、DHZ-DA大容量全溫振蕩器、752N型紫外可見分光光度計(jì)、PCR儀、恒溫金屬浴、水平/垂直電泳儀、藍(lán)光切膠儀、顯微鏡、電子天平、pH值等。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的雞α干擾素成熟肽序列，同時(shí)遵循畢赤酵母密碼子使用的偏好性和遺傳簡(jiǎn)并性原則，選用畢赤酵母的偏愛密碼子[5]，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)12條引物P1～P12，運(yùn)用重疊延伸PCR方法人工合成cIFN-α基因序列[6]。插入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k，在5′端起始密碼子前選擇酶切位點(diǎn)EcoR Ⅰ，在3′端終止密碼子后選擇酶切位點(diǎn)Not Ⅰ，在目的基因前面加入kex2、Ste13蛋白酶裂解位點(diǎn)，使外源基因表達(dá)產(chǎn)物具有天然的N端，并利用載體上的α信號(hào)肽序列得到分泌表達(dá)。

1.5 雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因序列的SOE（重疊延伸基因擴(kuò)增技術(shù)）

取引物P1～P4（10 μmol/L）各2 μL，PFU Mix 25 μL，用雙蒸水補(bǔ)至50 μL，PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 3 min，（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s）×30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。每組分別以P1～P4引物為第1組，P5～P8引物為第2組，P9～P12引物為第3組，按相同條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將反應(yīng)產(chǎn)物分別在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，將回收產(chǎn)物分別標(biāo)記為D1、D2、D3。

取D1、D2、D3各2 μL，引物P1、P12各1 μL，PFU Mix 25 μL，補(bǔ)充雙蒸水至總體積為50 μL，PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 3 min，（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s）×30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收，該回收產(chǎn)物即為擴(kuò)增的雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因序列，標(biāo)記為cIFN-α[STBX]2[STBZ]，雞α干擾素成熟肽天然基因標(biāo)記為cIFN-α[STBX]1[STBZ]。

1.6 cIFN-α重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將cIFN-α2基因片段和pPIC9k質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoR Ⅰ、Not Ⅰ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9k-cIFN-α2。將轉(zhuǎn)化菌落經(jīng)菌落PCR鑒定，提取陽性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.7 pPIC9k-cIFN-α2的5′非翻譯區(qū)的改造

將pPIC9k表達(dá)載體的非翻譯區(qū)序列與畢赤酵母全基因序列中的AOX1基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)pPIC9k質(zhì)粒的5′非翻譯區(qū)多出了8個(gè)核苷酸序列GGATCCAA，本試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)4條引物，應(yīng)用PCR方法擬去除表達(dá)重組載體信號(hào)肽mRNA 5′-UTR序列中的GGATCCAA序列[7]。首先在載體上改造位點(diǎn)（GGATCCAA）的上游找到Sac Ⅰ酶切位點(diǎn)，在目的基因下游找到Not Ⅰ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)3條引物E1、E2、E3，其中E1含有酶切位點(diǎn)Sac Ⅰ，E2、E3有互補(bǔ)序列，且內(nèi)部人為去除GGATCCAA序列，分別以E1、E2以及E3、P12為引物，以pPIC9k-cIFN-αR質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可擴(kuò)增得到長(zhǎng)度分別為732、824 bp左右的片段A、B。再將片段A、B進(jìn)行切膠回收后，用引物E1、P12利用重疊延伸PCR方法擴(kuò)增得到片段C，大小為1 532 bp。將片段C回收后與pPIC9k質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ、NotⅠ雙酶切后連接，即得到重組5′UTR區(qū)改造質(zhì)粒pPIC9k-cIFN-αR，進(jìn)一步進(jìn)行序列測(cè)定以驗(yàn)證結(jié)果。最終實(shí)現(xiàn)去掉5′-UTR多余的8個(gè)堿基，使得經(jīng)過改造的質(zhì)粒pPIC9k的5′-UTR與酵母基因組的AOX1完全相同，從而降低了可能引起的表達(dá)量降低或者不表達(dá)的可能性。

1.8 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SMD1168的篩選和鑒定

將重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅠ進(jìn)行單酶切后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168，將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布于MD（最小葡萄糖培養(yǎng)基）平板進(jìn)行培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出單菌落。挑選轉(zhuǎn)化子菌落，用裂解液進(jìn)行PCR模板的制備，用通用引物α-factor、3′AOX進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)濃度逐漸增高的G418抗生素篩選高拷貝克隆，用于表達(dá)目的蛋白。

1.9 雞α干擾素的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測(cè)

選取耐受2.0 mg/mL G418抗生素濃度的單菌落，每種重組質(zhì)粒各選取3個(gè)，以pPIC9k空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母作為陰性對(duì)照。將畢赤酵母從活化平板接種至YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基）搖瓶，于28 ℃、220 r/min 培養(yǎng)24 h，從YPD搖瓶中按1%的接種量接至BMGY（最小甘油緩沖液培養(yǎng)基）搖瓶中，于28 ℃、220 r/min培養(yǎng)16 h，4 000 r/min離心10 min取沉淀;用等體積的BMMY（最小甲醇緩沖液培養(yǎng)基）培養(yǎng)基重新懸浮菌體，于28 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h后，補(bǔ)加1%甲醇和磷酸鉀溶液1次，48 h后結(jié)束培養(yǎng)。將BMMY搖瓶菌液于12 000 r/min離心10 min，取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，對(duì)過濾上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和抗病毒活性檢測(cè)。

1.10 重組雞α干擾素的抗病毒活性檢測(cè)

采用微量細(xì)胞病變抑制法[8]測(cè)定重組雞α干擾素的抗病毒活性，具體步驟如下：取孵化9～10 d的SPF（無特定病原體）雞胚，去頭、四肢及內(nèi)臟，在無菌狀態(tài)下用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3遍后，剪碎，用0.25%胰酶于37 ℃消化后，再用無血清營(yíng)養(yǎng)液洗去胰酶，并用大孔吸管吹打成單個(gè)細(xì)胞后上96孔板，生長(zhǎng)約12 h使細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng)至單層后，去除生長(zhǎng)液。每孔加入10倍倍比稀釋的干擾素（用無血清營(yíng)養(yǎng)液稀釋）共 100 μL，每個(gè)稀釋度設(shè)6孔平行樣，孵育12 h后用100 TCID50劑量的水泡性口炎病毒進(jìn)行攻毒，同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照孔（不加干擾素，只加病毒）、陰性對(duì)照孔（只加干擾素，不加病毒）、空白對(duì)照孔（不加干擾素，不加病毒），大約12～24 h后在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。當(dāng)陽性對(duì)照孔出現(xiàn)75%以上病變時(shí)，判斷結(jié)果，以能抑制50%細(xì)胞病變的樣品干擾素稀釋度定義為1個(gè)單位干擾素。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增后的cIFN-α2基因產(chǎn)物片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)有1條清晰的條帶（圖1-a），預(yù)期大小為 696 bp，與DNA marker相比，大小與預(yù)期相符，回收后測(cè)序表明，序列正確，與設(shè)計(jì)相符合。

將cIFN-α2基因片段雙酶切后連入pPIC9k表達(dá)載體，用通用引物α-factor、3′AOX進(jìn)行菌落PCR篩選陽性克隆，將擴(kuò)增條帶進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果有明顯條帶被擴(kuò)增出來，與DNA marker比對(duì)可知，位于750 bp附近。擴(kuò)增出來的片段預(yù)計(jì)大小為696 bp，與PCR檢測(cè)的結(jié)果基本相符。選擇3個(gè)陽性克隆保種、提質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，載體連入序列正確，得到含雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因的pPIC9k表達(dá)載體。

2.2 pPIC9k-cIFN-α2的5′非翻譯區(qū)的改造

將擴(kuò)增后的A、B、C片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)位置均有1條清晰的條帶，經(jīng)檢測(cè)，大小正確，說明擴(kuò)增成功（圖2-a）。用通用引物對(duì)pPIC9k-cIFN-α2啟動(dòng)子改建轉(zhuǎn)化子的菌落PCR結(jié)果顯示，擴(kuò)增有明顯條帶（圖2-b），與DNA marker相比，位于1 600 bp附近。由于鑒定PCR中采用的是E1、3′AOX引物，因此擴(kuò)增出來的片段大小應(yīng)該是1 532 bp，與PCR檢測(cè)的結(jié)果基本相符（圖2-a）。選擇3個(gè)陽性克隆保種、提質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，載體連入序列正確，得到含有雞α干擾素成熟肽優(yōu)化基因的5′UTR區(qū)改造質(zhì)粒pPIC9k-cIFN-α2-E。

2.3 重組畢赤酵母的鑒定

將重組畢赤酵母菌株用通用引物α-factor、3′AOX進(jìn)行酵母菌落PCR驗(yàn)證，如圖3所示，篩選到的重組畢赤酵母在目標(biāo)位置出現(xiàn)了明顯條帶，與預(yù)期的696 bp一致，證明線性化的重組質(zhì)粒已經(jīng)被成功整合至畢赤酵母基因組中。

2.4 雞α干擾素的表達(dá)檢測(cè)

對(duì)篩選到的高拷貝陽性畢赤酵母重組子SMD1168-pPIC9k-cIFN-α1、SMD1168-pPIC9k-cIFN-α2、SMD1168-pPIC9k-cIFN-α2-E進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)，分別取48 h表達(dá)上清進(jìn)行12%SDS-PAGE。由圖4可以看出，在20 ku左右出現(xiàn)特異蛋白條帶，與預(yù)期分子量大小19 ku基本相符，而陰性對(duì)照未重組的SMD1168與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照SMD1168-pPIC9k未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。光密度掃描結(jié)果顯示，雞α干擾素優(yōu)化基因重組酵母的蛋白表達(dá)量大于天然基因重組酵母SMD1168-pPIC9k-cIFN-α1。

2.5 重組酵母表達(dá)雞α干擾素抗病毒活性的測(cè)定

病毒抑制法測(cè)定酵母表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性結(jié)果顯示，攻毒24 h后觀察到陽性對(duì)照孔出現(xiàn)100%的病變，陰性對(duì)照孔中是正常的雞胚成纖維細(xì)胞。從表1可以看出，雞α干擾素基因的優(yōu)化可以提高其表達(dá)水平，抗病毒效價(jià)明顯提高了

10倍;在優(yōu)化基因重組畢赤酵母的基礎(chǔ)上，對(duì)質(zhì)粒5′端非翻譯區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步改造后，表達(dá)蛋白的抗病毒活性提高了約50%。

3 討論與結(jié)論

研究表明，mRNA的5′端非翻譯區(qū)序列組成和長(zhǎng)度可影響翻譯效率，畢赤酵母是1種甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，能夠以甲醇為唯一碳源生長(zhǎng)[9]。與甲醇代謝相關(guān)的醇氧化酶AOX1基因受甲醇的嚴(yán)格調(diào)控并啟動(dòng)高效表達(dá)，醇氧化酶占細(xì)胞可溶性蛋白的35%，而對(duì)應(yīng)的mRNA僅僅占總mRNA的5%以下[10]，說明醇氧化酶mRNA的翻譯效率極高，其5′端非翻譯區(qū)有利于目的蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)。

Sreekrishna等通過改建人血清蛋白mRNA，使其與甲醇氧化酶基因AOX1 mRNA的5′UTR相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平提高了50倍以上[11]，說明AOX1的5′UTR對(duì)目的基因表達(dá)水平的影響比較大，具有相同的5′UTR有利于目的基因在畢赤酵母中的表達(dá)翻譯，而pPIC9k質(zhì)粒的5′UTR與AOX1的5′UTR的序列相比，多了8個(gè)堿基GGATCCAA，這可能成為限制目的蛋白表達(dá)的重要因素之一。

近年來的多數(shù)研究表明，由于不同物種對(duì)同義密碼子的使用頻率不同，外源基因，尤其是來自較遠(yuǎn)物種的基因在宿主中的表達(dá)會(huì)受到一定影響，通過對(duì)外源基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，可以提高其表達(dá)水平[12]。本研究運(yùn)用PCR方法，將pPIC9k質(zhì)粒5′UTR的8個(gè)核苷酸序列去除，使其與AOX1 的5′UTR序列相同，并對(duì)其雞α干擾素的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，將獲得的重組菌株在搖瓶水平進(jìn)行了甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果表明，與天然基因相比，密碼子優(yōu)化后的雞α干擾素重組酵母菌株的表達(dá)量得到了提高，抗病毒活性提高了10倍，在此基礎(chǔ)上，對(duì)pPIC9k質(zhì)粒的5′UTR進(jìn)行改造后，抗病毒活性提高了50%，說明其mRNA的5′非翻譯區(qū)的改造能有效提高雞α干擾素在畢赤酵母中的表達(dá)。本研究為提高雞α干擾素的工程菌表達(dá)效果提供了新的思路。

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