劉沃滿　唐玉芬　李祝坤

[摘要]目的 應用實時熒光定量PCR（realtime PCR）方法檢測妊娠晚期孕婦B族鏈球菌（GBS），了解妊娠晚期孕婦GBS的感染情況，為預防GBS感染提供依據(jù)。方法 選取2017年1月～2018年12月我院進行GBS檢測的10 691例孕婦。采用realtime PCR技術對孕婦陰道分泌物或陰道-直腸分泌物進行GBS檢測，并對檢測結果進行分析。結果 10 691例孕婦中GBS感染陽性1466例（13.71%）;陰道-直腸分泌物的陽性率（16.30%）高于陰道分泌物（9.18%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=106.139，P=0.000）;孕晚期>30～34歲組陽性率最高（15.32%），與≤20歲組陽性率（6.36%）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但與其他年齡組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;四季間GBS陽性率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論 應用realtime PCR方法對圍生期孕婦進行GBS篩查時，同時采集陰道和直腸分泌物聯(lián)合檢測，能明顯提高GBS的檢出率。GBS在妊娠晚期孕婦中的感染率較高，應加強對孕晚期孕婦的GBS篩檢，陽性者及時采取干預措施，降低新生兒GBS感染，改善母嬰結局。

[關鍵詞]實時熒光定量PCR;B族鏈球菌;妊娠晚期;陽性率

[中圖分類號] R714.25? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）10（c）-0138-03

[Abstract] Objective To apply real-time fluorescent quantitative PCR （realtime PCR） to detect group B Streptococcus （GBS） in pregnant women in the late pregnancy， and to understand GBS infection in pregnant women in the late pregnancy， so as to provide a basis for preventing GBS infection. Methods A total of 10 691 pregnant women undergoing GBS assay in our hospital from January 2017 and December 2018 were selected. GBS was detected in vaginal secretions or vaginal-rectal secretions of the pregnant women using realtime PCR， and the results were analyzed. Results Among the 10 691 pregnant women， 1466 women （13.71%） showed positive results in GBS infection. The positive rate （16.30%） of vaginal-rectal secretions was higher than that （9.18%） of vaginal secretions， with a statistically significant difference （χ2 =106.139， P=0.000）. The positive rate （15.32%） was the highest in pregnant women aged >30-34 years in the late pregnancy， and presented a statistically significant difference from the positive rate （6.36%） in pregnant women aged ≤20 years （P<0.05）. No statistically significant differences were found in the positive rate between pregnant women aged >30-34 years and pregnant women with other ages （P>0.05）. Conclusion The detection rate of GBS in pregnant women during the perinatal period can be significantly improved in GBS screening using realtime PCR and combined detection by collecting vaginal and rectal secretions simultaneously. The infection rate of GBS in pregnant women in the late pregnancy is relatively high. Therefore， GBS screening of pregnant women in the late pregnancy should be strengthened， and timely intervention measures should be taken in positive pregnant women to reduce GBS infection in newborns and improve maternal and infant outcomes.

[Key words] Real-time fluorescence quantitative PCR; B Streptococcus; Third trimester of pregnancy; Positive rate

B族鏈球菌（GBS）是一種革蘭陽性球菌，學名是無乳鏈球菌（S.agalactiae），正常寄居于女性陰道和直腸。它是一種條件致病菌，一般正常健康人群感染GBS并不致病，但妊娠晚期孕婦感染GBS時，可引起早產、產后出血、胎膜早破、胎兒窘迫等不良妊娠結局[1]，還可通過垂直傳播給新生兒[2]，引起新生兒肺炎、敗血癥及腦膜炎，造成新生兒死亡或神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。因此，進行產前GBS篩檢顯得尤為重要。本研究采用實時熒光定量PCR（realtime PCR）技術對妊娠晚期孕婦進行B族鏈球菌檢測，以了解妊娠晚期孕婦帶菌情況，為臨床有效防治孕婦GBS感染提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年1月～2018年12月我院進行GBS檢測的10 691例孕婦，其中陰道分泌物3889例，陰道-直腸分泌物有6802例。納入標準：①孕齡34～39周;②年齡14～55歲;③所有孕婦均經(jīng)B超檢查確認為單胎。排除標準：①近期使用抗菌藥物者;②產前明確胎兒畸形或死胎者;③合并嚴重心、肝、腎及免疫系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準和患者知情同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器? 采用上海之江生物科技股份有限公司的B族鏈球菌（GBS）核酸測定試劑盒（熒光PCR法），Bio Rad CFX96實時熒光定量PCR儀等。

1.2.2標本的處理與提取? 分泌物：標本試管中加入1 ml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，吸取液體轉至1.5 ml離心管中（如分泌物較多，只取0.2 ml）13 000 r/min離心5 min。沉淀加無菌生理鹽水1 ml震勻，13 000 r/min離心5 min，再重復洗滌1次。沉淀直接加入100 μl核酸提取液，充分混勻，99℃干浴10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清4 μl作為PCR反應模板。對照品：取試劑盒配套的陽性對照品、陰性對照品各100 μl，分別加入100 μl核酸提取液，充分混勻，99℃干浴10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清4 μl作為PCR反應模板。

1.2.3 PCR擴增? 取試劑混合液36 μl分別置于PCR反應管中，將標本、陽性對照品、陰性對照品的核酸提取物各4 μl分別加入PCR反應管中，蓋好管蓋，瞬時離心，立即在Bio Rad CFX96實時熒光定量PCR儀進行擴增，反應條件為：37℃×2 min;再按93℃×15 s→60℃×60 s，循環(huán)40次;單點熒光檢測在60℃。反應體系為40 μl。

1.2.4質量控制? 陰性對照品檢測結果為FAM通道Ct欄顯示N/A，且VIC通道Ct值≤38;陽性對照品檢測結果為FAM通道Ct值≤35，否則實驗視為無效。

1.3觀察指標及評價標準

利用熒光定量PCR儀配套軟件進行自動分析，得到各樣本和對照品（FCM）Ct值。在陰性對照品為Ct欄顯示N/A，且VIC通道Ct值≤38，陽性對照品檢測結果為Ct值≤35時，對各樣本的結果判讀如下：當樣本Ct值≤38且有較好的對數(shù)增長曲線時，判定為GBS陽性;當樣本Ct值為“Undet”或N/A或NoCt時，判定為GBS陰性（低于檢測下限）;當樣本38

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 GBS檢出情況

在10 691例孕婦標本中，檢出GBS陽性1466例，陽性率為13.71%。

2.2單獨檢測陰道分泌物和聯(lián)合檢測陰道-直腸分泌物結果的比較

單獨檢測陰道分泌物3889例，共檢出GBS陽性357例，陽性率為9.18%;同時檢測陰道-直腸分泌物6802例，共檢出GBS陽性1109例，陽性率為16.30%，兩組差異有統(tǒng)計學意義（χ2=106.139，P=0.000）。

2.3各年齡組妊娠晚期孕婦GBS陽性率的比較

各年齡組妊娠晚期孕婦GBS陽性率中，以>30～34歲組陽性率最高（15.32%），與≤20歲組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但與其他年齡組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表1）。

2.4 GBS不同季節(jié)的分布情況

根據(jù)季節(jié)分布情況，第1～4季GBS陽性檢出率依次為13.41%、11.30%、14.73%、14.66%。四個季度間GBS陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表2）。

3討論

Realtime PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。細菌培養(yǎng)法是目前檢測GBS感染的金標準，但需要培養(yǎng)時間長，易受其他細菌影響導致假陰性，條件要求高，檢測率低[3]。應用realtimePCR技術檢測GBS與細菌培養(yǎng)法比較，具有幾個優(yōu)點。①快速：可在2～4 h得出結果，并且可檢測到死亡的GBS[4]。②靈敏性和特異性高：國內外研究表明，RealtimePCR技術檢測GBS的檢出率高，靈敏性可達95%～100%，特異性可達94.9%～99.6%[5-8]。③自動化程度高，通量大：從標本DNA提取、PCR擴增及結果分析均可通過相應的儀器和軟件來完成，易于標準化。一次可檢測96個樣本，通量大。

近年來，國內研究發(fā)現(xiàn)GBS在圍生期感染中是第1位的致病菌[9-10]，不僅導致孕婦胎膜早破，早產等不良妊娠結局，還可通過垂直傳播給胎兒，引起胎兒窘迫、新生兒黃疸等不良結局。美國自上世紀90年代開始由CDC出版圍生期GBS的防治指南并持續(xù)改進，產前GBS的篩查大大降低了新生兒GBS感染性疾病的發(fā)生率[11]。而在不同國家、地區(qū)的妊娠婦女帶菌率有一定的差異，可能與職業(yè)、種族、檢測方法有關[12]。本研究結果顯示，10 691例晚期妊娠婦女感染GBS1466例，陽性率為13.71%。數(shù)據(jù)比長沙地區(qū)7.4%[13]，延邊地區(qū)的3.44%[14]和中山市的6.70%[15]都高，比惠州市的32.4%[16]、陳明發(fā)等[17]報道的19.51%低，與陳海迎等[18-20]報道的14.09%、13.57%[19]相近。單采集陰道分泌物的3889例，檢出GBS共有357例，陽性率為9.18%;雙采集陰道-直腸分泌物的6802例，檢出GBS共有1109例，陽性率為16.30%。雙采集陰道-直腸分泌物的陽性率明顯高于單采集陰道分泌物，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示圍生期孕婦GBS篩查時應同時采集陰道和直腸分泌物聯(lián)合檢測，能明顯提高GBS的檢出率[2]。本研究中>30～34歲組孕婦GBS陽性率最高（15.32%），與≤20歲組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與季修慶等[20]報道的相似。從四季GBS檢出情況可看出，秋、冬季的陽性率比春、夏季高，但四季間的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

綜上所述，應用Realtime PCR方法對圍生期孕婦進行GBS篩查時，同時采集陰道和直腸分泌物聯(lián)合檢測，能明顯提高GBS的檢出率。GBS在妊娠晚期孕婦中的感染率較高，尤其是年齡>30～34歲組陽性率最高。應加強對孕晚期孕婦的GBS篩檢，陽性者及時采取干預措施，降低新生兒GBS感染，改善母嬰結局。

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（收稿日期：2019-03-18? 本文編輯：崔建中）