劉沃滿　唐玉芬　李祝坤

[摘要]目的 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime PCR）方法檢測(cè)妊娠晚期孕婦B族鏈球菌（GBS），了解妊娠晚期孕婦GBS的感染情況，為預(yù)防GBS感染提供依據(jù)。方法 選取2017年1月～2018年12月我院進(jìn)行GBS檢測(cè)的10 691例孕婦。采用realtime PCR技術(shù)對(duì)孕婦陰道分泌物或陰道-直腸分泌物進(jìn)行GBS檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果 10 691例孕婦中GBS感染陽(yáng)性1466例（13.71%）;陰道-直腸分泌物的陽(yáng)性率（16.30%）高于陰道分泌物（9.18%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=106.139，P=0.000）;孕晚期>30～34歲組陽(yáng)性率最高（15.32%），與≤20歲組陽(yáng)性率（6.36%）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但與其他年齡組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;四季間GBS陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 應(yīng)用realtime PCR方法對(duì)圍生期孕婦進(jìn)行GBS篩查時(shí)，同時(shí)采集陰道和直腸分泌物聯(lián)合檢測(cè)，能明顯提高GBS的檢出率。GBS在妊娠晚期孕婦中的感染率較高，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)孕晚期孕婦的GBS篩檢，陽(yáng)性者及時(shí)采取干預(yù)措施，降低新生兒GBS感染，改善母嬰結(jié)局。

[關(guān)鍵詞]實(shí)時(shí)熒光定量PCR;B族鏈球菌;妊娠晚期;陽(yáng)性率

[中圖分類號(hào)] R714.25? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）10（c）-0138-03

[Abstract] Objective To apply real-time fluorescent quantitative PCR （realtime PCR） to detect group B Streptococcus （GBS） in pregnant women in the late pregnancy， and to understand GBS infection in pregnant women in the late pregnancy， so as to provide a basis for preventing GBS infection. Methods A total of 10 691 pregnant women undergoing GBS assay in our hospital from January 2017 and December 2018 were selected. GBS was detected in vaginal secretions or vaginal-rectal secretions of the pregnant women using realtime PCR， and the results were analyzed. Results Among the 10 691 pregnant women， 1466 women （13.71%） showed positive results in GBS infection. The positive rate （16.30%） of vaginal-rectal secretions was higher than that （9.18%） of vaginal secretions， with a statistically significant difference （χ2 =106.139， P=0.000）. The positive rate （15.32%） was the highest in pregnant women aged >30-34 years in the late pregnancy， and presented a statistically significant difference from the positive rate （6.36%） in pregnant women aged ≤20 years （P<0.05）. No statistically significant differences were found in the positive rate between pregnant women aged >30-34 years and pregnant women with other ages （P>0.05）. Conclusion The detection rate of GBS in pregnant women during the perinatal period can be significantly improved in GBS screening using realtime PCR and combined detection by collecting vaginal and rectal secretions simultaneously. The infection rate of GBS in pregnant women in the late pregnancy is relatively high. Therefore， GBS screening of pregnant women in the late pregnancy should be strengthened， and timely intervention measures should be taken in positive pregnant women to reduce GBS infection in newborns and improve maternal and infant outcomes.

[Key words] Real-time fluorescence quantitative PCR; B Streptococcus; Third trimester of pregnancy; Positive rate

B族鏈球菌（GBS）是一種革蘭陽(yáng)性球菌，學(xué)名是無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae），正常寄居于女性陰道和直腸。它是一種條件致病菌，一般正常健康人群感染GBS并不致病，但妊娠晚期孕婦感染GBS時(shí)，可引起早產(chǎn)、產(chǎn)后出血、胎膜早破、胎兒窘迫等不良妊娠結(jié)局[1]，還可通過(guò)垂直傳播給新生兒[2]，引起新生兒肺炎、敗血癥及腦膜炎，造成新生兒死亡或神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。因此，進(jìn)行產(chǎn)前GBS篩檢顯得尤為重要。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime PCR）技術(shù)對(duì)妊娠晚期孕婦進(jìn)行B族鏈球菌檢測(cè)，以了解妊娠晚期孕婦帶菌情況，為臨床有效防治孕婦GBS感染提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年1月～2018年12月我院進(jìn)行GBS檢測(cè)的10 691例孕婦，其中陰道分泌物3889例，陰道-直腸分泌物有6802例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①孕齡34～39周;②年齡14～55歲;③所有孕婦均經(jīng)B超檢查確認(rèn)為單胎。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期使用抗菌藥物者;②產(chǎn)前明確胎兒畸形或死胎者;③合并嚴(yán)重心、肝、腎及免疫系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器? 采用上海之江生物科技股份有限公司的B族鏈球菌（GBS）核酸測(cè)定試劑盒（熒光PCR法），Bio Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等。

1.2.2標(biāo)本的處理與提取? 分泌物：標(biāo)本試管中加入1 ml無(wú)菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，吸取液體轉(zhuǎn)至1.5 ml離心管中（如分泌物較多，只取0.2 ml）13 000 r/min離心5 min。沉淀加無(wú)菌生理鹽水1 ml震勻，13 000 r/min離心5 min，再重復(fù)洗滌1次。沉淀直接加入100 μl核酸提取液，充分混勻，99℃干浴10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清4 μl作為PCR反應(yīng)模板。對(duì)照品：取試劑盒配套的陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品各100 μl，分別加入100 μl核酸提取液，充分混勻，99℃干浴10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清4 μl作為PCR反應(yīng)模板。

1.2.3 PCR擴(kuò)增? 取試劑混合液36 μl分別置于PCR反應(yīng)管中，將標(biāo)本、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品的核酸提取物各4 μl分別加入PCR反應(yīng)管中，蓋好管蓋，瞬時(shí)離心，立即在Bio Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：37℃×2 min;再按93℃×15 s→60℃×60 s，循環(huán)40次;單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃。反應(yīng)體系為40 μl。

1.2.4質(zhì)量控制? 陰性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果為FAM通道Ct欄顯示N/A，且VIC通道Ct值≤38;陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果為FAM通道Ct值≤35，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

1.3觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

利用熒光定量PCR儀配套軟件進(jìn)行自動(dòng)分析，得到各樣本和對(duì)照品（FCM）Ct值。在陰性對(duì)照品為Ct欄顯示N/A，且VIC通道Ct值≤38，陽(yáng)性對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果為Ct值≤35時(shí)，對(duì)各樣本的結(jié)果判讀如下：當(dāng)樣本Ct值≤38且有較好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)曲線時(shí)，判定為GBS陽(yáng)性;當(dāng)樣本Ct值為“Undet”或N/A或NoCt時(shí)，判定為GBS陰性（低于檢測(cè)下限）;當(dāng)樣本38

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 GBS檢出情況

在10 691例孕婦標(biāo)本中，檢出GBS陽(yáng)性1466例，陽(yáng)性率為13.71%。

2.2單獨(dú)檢測(cè)陰道分泌物和聯(lián)合檢測(cè)陰道-直腸分泌物結(jié)果的比較

單獨(dú)檢測(cè)陰道分泌物3889例，共檢出GBS陽(yáng)性357例，陽(yáng)性率為9.18%;同時(shí)檢測(cè)陰道-直腸分泌物6802例，共檢出GBS陽(yáng)性1109例，陽(yáng)性率為16.30%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=106.139，P=0.000）。

2.3各年齡組妊娠晚期孕婦GBS陽(yáng)性率的比較

各年齡組妊娠晚期孕婦GBS陽(yáng)性率中，以>30～34歲組陽(yáng)性率最高（15.32%），與≤20歲組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但與其他年齡組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.4 GBS不同季節(jié)的分布情況

根據(jù)季節(jié)分布情況，第1～4季GBS陽(yáng)性檢出率依次為13.41%、11.30%、14.73%、14.66%。四個(gè)季度間GBS陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3討論

Realtime PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。細(xì)菌培養(yǎng)法是目前檢測(cè)GBS感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但需要培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，易受其他細(xì)菌影響導(dǎo)致假陰性，條件要求高，檢測(cè)率低[3]。應(yīng)用realtimePCR技術(shù)檢測(cè)GBS與細(xì)菌培養(yǎng)法比較，具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。①快速：可在2～4 h得出結(jié)果，并且可檢測(cè)到死亡的GBS[4]。②靈敏性和特異性高：國(guó)內(nèi)外研究表明，RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)GBS的檢出率高，靈敏性可達(dá)95%～100%，特異性可達(dá)94.9%～99.6%[5-8]。③自動(dòng)化程度高，通量大：從標(biāo)本DNA提取、PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析均可通過(guò)相應(yīng)的儀器和軟件來(lái)完成，易于標(biāo)準(zhǔn)化。一次可檢測(cè)96個(gè)樣本，通量大。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)GBS在圍生期感染中是第1位的致病菌[9-10]，不僅導(dǎo)致孕婦胎膜早破，早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局，還可通過(guò)垂直傳播給胎兒，引起胎兒窘迫、新生兒黃疸等不良結(jié)局。美國(guó)自上世紀(jì)90年代開(kāi)始由CDC出版圍生期GBS的防治指南并持續(xù)改進(jìn)，產(chǎn)前GBS的篩查大大降低了新生兒GBS感染性疾病的發(fā)生率[11]。而在不同國(guó)家、地區(qū)的妊娠婦女帶菌率有一定的差異，可能與職業(yè)、種族、檢測(cè)方法有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，10 691例晚期妊娠婦女感染GBS1466例，陽(yáng)性率為13.71%。數(shù)據(jù)比長(zhǎng)沙地區(qū)7.4%[13]，延邊地區(qū)的3.44%[14]和中山市的6.70%[15]都高，比惠州市的32.4%[16]、陳明發(fā)等[17]報(bào)道的19.51%低，與陳海迎等[18-20]報(bào)道的14.09%、13.57%[19]相近。單采集陰道分泌物的3889例，檢出GBS共有357例，陽(yáng)性率為9.18%;雙采集陰道-直腸分泌物的6802例，檢出GBS共有1109例，陽(yáng)性率為16.30%。雙采集陰道-直腸分泌物的陽(yáng)性率明顯高于單采集陰道分泌物，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示圍生期孕婦GBS篩查時(shí)應(yīng)同時(shí)采集陰道和直腸分泌物聯(lián)合檢測(cè)，能明顯提高GBS的檢出率[2]。本研究中>30～34歲組孕婦GBS陽(yáng)性率最高（15.32%），與≤20歲組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與季修慶等[20]報(bào)道的相似。從四季GBS檢出情況可看出，秋、冬季的陽(yáng)性率比春、夏季高，但四季間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

綜上所述，應(yīng)用Realtime PCR方法對(duì)圍生期孕婦進(jìn)行GBS篩查時(shí)，同時(shí)采集陰道和直腸分泌物聯(lián)合檢測(cè)，能明顯提高GBS的檢出率。GBS在妊娠晚期孕婦中的感染率較高，尤其是年齡>30～34歲組陽(yáng)性率最高。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)孕晚期孕婦的GBS篩檢，陽(yáng)性者及時(shí)采取干預(yù)措施，降低新生兒GBS感染，改善母嬰結(jié)局。

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（收稿日期：2019-03-18? 本文編輯：崔建中）