張曄 李媛 史文心 周酈楠

【摘要】 目的 探討脊髓損傷（SCI）急性期不同時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞介素-6（IL-6）表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其意義， 為SCI的治療提供理論依據(jù)。方法 120只Wistar大鼠， 隨機(jī)分成正常對(duì)照組（8只）、Sham組（56只）、SCI組（56只）， Sham組和SCI組分別于術(shù)后0、2、4、8、12、24、48 h取材。正常對(duì)照組大鼠未進(jìn)行手術(shù)操作， Sham組只咬除棘突并且不損傷脊髓， SCI組采用改良Allen s撞擊法制備大鼠急性SCI模型， 比較三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的行為學(xué)評(píng)分法（BBB）評(píng)分及脊髓組織中IL-6的表達(dá)。結(jié)果 SCI組大鼠術(shù)后BBB評(píng)分均低于正常對(duì)照組及Sham組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;且術(shù)后48 h BBB評(píng)分高于術(shù)后4 h， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SCI組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)大鼠脊髓組織中IL-6的表達(dá)高于正常對(duì)照組及Sham組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， 且于術(shù)后12 h達(dá)高峰， 隨后IL-6的表達(dá)下降。Sham組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的脊髓組織中IL-6的表達(dá)有所增高， 但與正常對(duì)照組比較， 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 IL-6在 SCI急性期明顯升高， IL-6參與急性 SCI的繼發(fā)性損害。

【關(guān)鍵詞】 脊髓損傷;急性期;白細(xì)胞介素-6;動(dòng)態(tài)變化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.32.107

SCI是臨床常見(jiàn)的高致殘率中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病， 是脊柱損傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥。它可導(dǎo)致?lián)p傷部位的出血、水腫， 神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死， 損傷平面以下的運(yùn)動(dòng)功能喪失， 以及感覺(jué)反射的減弱或消失 [1]。SCI患者給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的痛苦與負(fù)擔(dān)[2]。一般外力作用下的SCI不能造成脊髓解剖上的完全橫斷， 而脊髓功能喪失主要是由于急性損傷后脊髓缺血缺氧引起的繼發(fā)性損害[3]。SCI后多種炎性因子的表達(dá)增加， 炎性因子的表達(dá)可導(dǎo)致相應(yīng)的炎性細(xì)胞進(jìn)入受損的脊髓產(chǎn)生炎性反應(yīng)， 導(dǎo)致受損區(qū)域內(nèi)部環(huán)境紊亂， 并且不可能重建SCI中受損的軸突， 從而加重SCI。減少繼發(fā)性損傷是避免SCI進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定SCI中不同時(shí)間點(diǎn)IL-6的表達(dá)， 尋找治療的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)， 為SCI的治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠120只（由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供）， 體重（200±20）g， 分籠飼養(yǎng)， 自然光照， 自由飲食、飲水， 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1. 2 試劑儀器 大鼠IL-6酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）;DY89-Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;DR-200Bs酶標(biāo)分析儀（無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司）。

1. 3 實(shí)驗(yàn)方法

1. 3. 1 實(shí)驗(yàn)分組 將120只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（8只）、Sham組（56只）、SCI組（56只）。Sham組和SCI組分別于術(shù)后0、2、4、8、12、24、48 h取材， 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取8只大鼠。

1. 3. 2 大鼠SCI模型制備及術(shù)后處理 術(shù)前將大鼠禁食水12 h， 腹腔麻醉（1%戊巴比妥鈉， 40 ml/kg體重）。麻醉起效后， 將大鼠俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)上， 術(shù)區(qū)備皮， 常規(guī)消毒鋪巾。以T10為中心做背部正中切口， 分離皮下組織及骨骼肌， 暴露T9～11， 剔除該節(jié)段棘突及椎板（操作中保持硬脊膜完整）， 顯露相應(yīng)脊髓節(jié)段作為造模區(qū)。采用改良的Allens撞擊法[4]， 使8 g（直徑2 mm）金屬圓柱體從高度50 mm處通過(guò)導(dǎo)管（內(nèi)徑2.5 mm）自由落下， 對(duì)大鼠脊髓進(jìn)行定量打擊（撞擊力為下落高度50 mm×圓柱體重量8 g）， 建立大鼠急性SCI模型。造模成功的標(biāo)志：大鼠表現(xiàn)出尾部短暫搖擺， 雙后肢和身體回縮式撲動(dòng)， 繼而雙后肢呈遲緩性癱瘓。逐層縫合。術(shù)后常規(guī)護(hù)理， 人工輔助白天每4 h排尿、排便1次， 直至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死。正常對(duì)照組未進(jìn)行手術(shù)操作;Sham組只咬除棘突并且不損傷脊髓。

1. 3. 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材 Sham組和SCI組分別于術(shù)后0、2、4 、8、12、24、48 h處死各組大鼠， 正常對(duì)照組于術(shù)后48 h處死。沿原手術(shù)切口， 取出損傷段和上下各5 mm的脊髓組織， 稱重。按1︰9比例加入生理鹽水， 用電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)研磨脊髓組織， 并于離心機(jī)上以3000 r/min離心10 min， 取上清液， -20℃保存。

1. 3. 4 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分及脊髓組織中IL-6的表達(dá)。采用BBB對(duì)各組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分， 分值為0～22分， 0分為完全癱瘓， 22分為完全正常， 評(píng)分越高表示大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能越好[5]。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)脊髓組織中IL-6的表達(dá)。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

大鼠在麻醉后進(jìn)行SCI手術(shù)操作， 術(shù)后約1～2 h清醒。清醒后大鼠行動(dòng)遲緩、二便障礙、雙下肢癱瘓， 進(jìn)食、進(jìn)水情況較差。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡3只大鼠：SCI組和Sham組大鼠過(guò)度麻醉各死亡1只， SCI組大鼠術(shù)后因泌尿系感染死亡1只。Sham組大鼠因手術(shù)操作失誤至下肢輕度功能障礙剔除2只。其余大鼠均存活至取材時(shí)間點(diǎn)， 各組死亡及剔除大鼠于實(shí)驗(yàn)中隨時(shí)補(bǔ)齊。

2. 1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分比較 正常對(duì)照組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分均為滿分21分。Sham組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分均為滿分21分。SCI組大鼠術(shù)前BBB評(píng)分為滿分;術(shù)后， SCI組4、8、12、24、48h的BBB評(píng)分分別為（0.1±0.316）、（0.2±0.422）、（0.6±0.699）、（1.2±0.632）、（1.9±0.876）分， 均低于正常對(duì)照組及Sham組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;且術(shù)后48 hBBB評(píng)分高于術(shù)后4 h， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2. 2 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)脊髓組織中IL-6的表達(dá)比較 正常對(duì)照組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的脊髓組織中IL-6的表達(dá)較少， Sham組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的脊髓組織中IL-6的表達(dá)有所增高， 但與正常對(duì)照組比較， 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。SCI組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)大鼠脊髓組織中IL-6的表達(dá)高于正常對(duì)照組及Sham組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， 且于術(shù)后12 h達(dá)高峰， 隨后IL-6的表達(dá)下降。見(jiàn)表1， 圖2。

3 討論

在脊髓發(fā)生原發(fā)性損傷后， 隨之而來(lái)的繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致神經(jīng)通路損傷和功能障礙的主要原因[6]。炎性細(xì)胞因子及炎性反應(yīng)在繼發(fā)性損傷的各種機(jī)制中起著重要作用， IL-6又是其中主要成員[7]。作為細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的介質(zhì)， 它廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能， 維持動(dòng)物體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。正常情況下， 神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)IL-6水平表達(dá)比較低， 但一定濃度的IL-6是維持神經(jīng)細(xì)胞正常生長(zhǎng)和生存的基礎(chǔ)， 而且還會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和生存。

本驗(yàn)結(jié)果顯示， SCI組大鼠術(shù)后BBB評(píng)分均低于正常對(duì)照組及Sham組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;且術(shù)后48 h?BBB評(píng)分高于術(shù)后4 h， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SCI組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)大鼠脊髓組織中IL-6的表達(dá)高于正常對(duì)照組及Sham組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）， 且于術(shù)后12 h達(dá)高峰， 隨后IL-6的表達(dá)下降。Sham組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的脊髓組織中IL-6的表達(dá)有所增高， 但與正常對(duì)照組比較， 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

IL-6是炎性細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子[8]。IL-6對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響是雙向的， 不僅可以促進(jìn)激活的巨噬細(xì)胞分化和浸潤(rùn)， 還可以上調(diào)其他細(xì)胞因子的表達(dá)， 從而加強(qiáng)炎性反應(yīng)。IL-6過(guò)度表達(dá)引起脊髓繼發(fā)性損傷的同時(shí)也促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化[9， 10]。研究促炎因子達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)、阻斷SCI期間的繼發(fā)性損傷是SCI早期治療的最主要目標(biāo)。

綜上所述， IL-6在 SCI急性期明顯升高， IL-6參與急性 SCI的繼發(fā)性損害。

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[收稿日期：2019-03-19]