柴 華，劉鑫瑩，李建華

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150000）

豬腎上皮細(xì)胞（PK-15）來源于豬腎，源自成年豬腎細(xì)胞PK-2a，體外貼壁生長，可連續(xù)傳代培養(yǎng)。該細(xì)胞對豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒等多種病毒敏感，在疫苗生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用[1-6]。本研究對PK-15 細(xì)胞的基本生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在開展PK-15 細(xì)胞及多種疫苗的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用PK-15 細(xì)胞購自中國獸醫(yī)藥品檢查所，DMEM 購自美國gibco，新生牛血清購自美國CLARK，0.25%胰蛋白酶購自美國gibco，秋水仙素購自美國sigma。試驗儀器為CO2培養(yǎng)箱（美國ThermoFisher，參數(shù)設(shè)置為37 ℃，5% CO2），相差倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇

自液氮罐取出一支凍存PK-15細(xì)胞，于37 ℃水浴鍋中解凍，離心后棄掉上清，用培養(yǎng)基重懸后接種至細(xì)胞瓶中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞生達(dá)到90%匯合度時進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞傳代

從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，加入0.25%的胰酶消化液，將方瓶置于37 ℃培養(yǎng)箱中，待觀察到個體清晰、細(xì)胞之間界限分明時，搖晃細(xì)胞從瓶壁上脫落時，培養(yǎng)基終止膜酶消化作用，吹打至形成單細(xì)胞懸液，按密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 鑒定

細(xì)胞形態(tài)：用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。生長曲線：將PK-15 細(xì)胞按密度為4.0×105cells ·mL-1接種至T25細(xì)胞瓶中，每隔24 h進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，繪制細(xì)胞增殖曲線。無菌檢驗：按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗。支原體檢驗：按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗。外源病毒檢測：取待檢細(xì)胞，反復(fù)凍融3 次，接種Vero 細(xì)胞、MDBK 細(xì)胞和ST細(xì)胞。細(xì)胞單層樣品經(jīng)甲醇定后，用適宜的熒光抗體進(jìn)行染色，檢查每一組細(xì)胞單層是否存在牛病毒性腹瀉病毒、豬細(xì)小病毒和豬瘟病毒外源病毒的熒光。當(dāng)陽性對照出現(xiàn)特異熒光，正常細(xì)胞無熒光時，如果被檢樣品出現(xiàn)外源性病毒特異性熒光，判為存在相應(yīng)病毒污染而樣品不合格。胞核學(xué)檢查：取PK-15細(xì)胞，加入含0.1μg·mL-1秋水仙素的培養(yǎng)液作用2～4 h，離心棄去培養(yǎng)液。用Eargle's等滲鹽水清洗，離心棄去液體，加入含1%酚紅的低滲液（1 L水加入1 mol·L-1NaHCO34滴），37 ℃作用30 min。加入醋酸∕甲醛固定液，與細(xì)胞反應(yīng)25 min。在加熱板上加熱至60 ℃，滴加1 mol·L-1鹽酸作用10 min。用姬姆薩染色液染色后油鏡下觀察，取50個處于有絲分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行檢查，對染色體計數(shù)，觀察染色體組型。細(xì)胞致瘤性檢驗：用裸鼠20 只，隨機(jī)分成3 組。第1 組10 只裸鼠，各皮下接種107個PK-15 細(xì)胞；第2 組5 只裸鼠，各經(jīng)皮下接種107個人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）作為陽性對照；第3組5只裸鼠，各經(jīng)皮下接種107個人胚肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）作為陰性對照。接種后逐日觀察有無結(jié)節(jié)或腫瘤形成，21 d剖檢第1組裸鼠5只；剩余5只裸鼠，繼續(xù)觀察，12周后全部剖檢。陽性和陰性對照組觀察21 d 全部剖檢，剖檢后觀察淋巴結(jié)和器官有無結(jié)節(jié)形成。

2 試驗結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

PK-15 細(xì)胞置顯微鏡下觀察如圖1，細(xì)胞為不規(guī)則多邊形，輪廓清晰，細(xì)胞形態(tài)較好。

2.2 生長曲線

PK-15 細(xì)胞生長曲線成S 型，如圖2，細(xì)胞生長經(jīng)歷了潛伏期、增殖期和停滯期。其中，細(xì)胞在48～120 h 增殖較快，細(xì)胞培養(yǎng)72 h 細(xì)胞密度約為43.0×105cells·mL-1。

圖1 PK-15細(xì)胞

圖2 細(xì)胞增殖曲線

2.3 無菌檢驗結(jié)果

按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，PK-15細(xì)胞檢驗結(jié)果為陰性。

2.4 支原體檢驗結(jié)果

按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，PK-15細(xì)胞檢驗結(jié)果為支原體陰性。

2.5 外源病毒檢測結(jié)果

按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行PK-15 細(xì)胞檢測，熒光抗體檢測結(jié)果為陰性，結(jié)果如圖3～5。

圖3 BVDV熒光抗體檢測結(jié)果

圖4 CSFV熒光抗體檢測結(jié)果

圖5 PPV熒光抗體檢測結(jié)果

2.6 細(xì)胞致瘤性檢驗

將PK-15 細(xì)胞頸部皮下接種裸鼠，21 d 及12周剖檢裸鼠，裸鼠各個淋巴結(jié)和器官均無結(jié)節(jié)形成，陽性對照組出現(xiàn)明顯腫瘤，陰性對照組裸鼠均無結(jié)節(jié)形成，PK-15細(xì)胞無致瘤性。

2.7 胞核學(xué)檢查

細(xì)胞染色體標(biāo)本經(jīng)姬姆薩染色，對有絲分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行檢查，染色體數(shù)為19×2，染色體形態(tài)見圖6。

圖6 PK-15細(xì)胞染色體

3 結(jié) 論

本研究對PK-15 細(xì)胞進(jìn)行生長動力學(xué)鑒定、無菌檢驗、支原體檢驗、核型分析及致瘤性檢驗，結(jié)果表明，PK-15細(xì)胞為純凈細(xì)胞株。PK-15細(xì)胞培養(yǎng)過程中能保持相對穩(wěn)定的遺傳特性，為疫苗的生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。同時，豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒等病毒能夠在PK-15 細(xì)胞系中穩(wěn)定、高效價的增殖，為豬細(xì)圓環(huán)病毒疫苗及豬細(xì)小病毒滅活疫苗的研究及開發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。