張婷，王凌偉

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率亦位居我國惡性腫瘤之首［1］。肺癌主要包括非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC），其中NSCLC發(fā)病率較高，約占所有肺癌患者的80%。但目前NSCLC尚缺乏早期有效的診斷指標(biāo)，故導(dǎo)致約75%的NSCLC患者確診時已處于晚期，5年存活率僅為17%。

外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑為30～100 nm的亞細(xì)胞囊泡，早在上個世紀(jì)就已被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并認(rèn)為是丟棄、不需要的細(xì)胞組分的“垃圾桶”［2］。近年研究表明，外泌體可在細(xì)胞間傳遞重要分子信號，可作用于靶細(xì)胞并參與調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)及各種信號通路［3］；此外，外泌體及其內(nèi)部物質(zhì)可反映親本細(xì)胞的性質(zhì)，因此推測來源于腫瘤細(xì)胞的外泌體可以檢測到腫瘤相關(guān)標(biāo)志物。微小RNAs（miRNAs）是由內(nèi)源性發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物衍生的一種長19～25 nt的單鏈RNAs，其在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，其中部分miRNAs甚至扮演著抑癌基因和原癌基因的角色［4］。本研究采用高通量測序技術(shù)檢測4例NSCLC患者和4例健康志愿者外周血外泌體中miRNAs表達(dá)并篩選差異表達(dá)的miRNAs，旨在為NSCLC的早期、無創(chuàng)診斷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般材料 收集2018年1月—2019年1月于深圳市人民醫(yī)院就診的4例NSCLC患者的外周血樣品，均經(jīng)組織病理學(xué)確診，其中肺腺癌（LUAD）2例、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）2例；另收集同期4例健康志愿者的外周血樣品作為對照，NSCLC患者和健康志愿者臨床資料見表1。本研究經(jīng)深圳市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，且收集外周血樣品前已取得受試者知情同意。

1.2 主要試劑與儀器 （1）主要試劑：exoRNEasy試劑盒、QIAzol試劑盒（德國QAGEN公司生產(chǎn)），CD63熒光標(biāo)記抗體、CD81熒光標(biāo)記抗體（英國Abcam公司生產(chǎn)），丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺（美國Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)）。（2）主要儀器：HiSeq 2500高通量測序儀（美國Illumina公司生產(chǎn)），-80 ℃超低溫冰箱（美國Harris公司生產(chǎn)），低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司生產(chǎn)），PAGE膠電泳儀（美國Bio-Rad公司生產(chǎn)），流式細(xì)胞儀FACSCantoTMⅡ（美國BD公司生產(chǎn)）。

表1 4例NSCLC患者和4例健康志愿者臨床資料Table 1 Clinical data of the 4 patients with NSCLC and 4 healthy volunteers

1.3 方法

1.3.1 外泌體的提取和鑒定 收集NSCLC患者和健康志愿者外周靜脈血5 ml，置于-4 ℃環(huán)境下過夜，之后2 000×g離心5 min，取上層血清于1.5 ml無菌EP管中并置于-80 ℃冰箱中保存待測。按照exoRNEasy試劑盒操作步驟提取外泌體，使用電鏡分析外泌體粒徑大小并采用外泌體特異性標(biāo)記蛋白CD63和CD81熒光標(biāo)記抗體，之后使用流式細(xì)胞儀FACSCantoTMⅡ檢測分離到的外泌體陽性百分比。

1.3.2 外泌體RNAs提取及miRNAs測序 按照QIAzol試劑盒操作步驟提取NSCLC患者和健康志愿者外周靜脈血外泌體總RNAs，并使用PAGE膠分離不同片段大小的RNA，切取介于18～30 nt的條帶，回收miRNAs。符合純度和濃度檢測標(biāo)準(zhǔn)后，采用HiSeq 2500高通量測序儀進(jìn)行miRNAs測序，得到測序數(shù)據(jù)后通過數(shù)據(jù)過濾去除低質(zhì)量和被污染的序列，與人類參考基因組序列（hg19）進(jìn)行比對并采用miRBase數(shù)據(jù)庫［5］進(jìn)行注釋，分析得出NSCLC患者和健康志愿者外周靜脈血外泌體中miRNAs種類及支持序列數(shù)（reads）。以每100萬個堿基在染色體中位置上的讀值定位到外顯子的每1 000個堿基上的轉(zhuǎn)錄本數(shù)（transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads，TPM）計算每個miRNAs在外周血樣品中的表達(dá)量。

1.3.3 miRNAs差異表達(dá)分析 DESeq2軟件是基于負(fù)二項分布模型進(jìn)行差異基因表達(dá)篩選的工具［6］，采用DESeq2軟件計算NSCLC患者和健康志愿者外周血外泌體中miRNAs差異倍數(shù)（fold changes，F(xiàn)C），采用Benjamini-Hochberg法［6］對原有假設(shè)檢驗得到的P值進(jìn)行校正，從而得到每個差異表達(dá)的miRNAs的偽發(fā)現(xiàn)率（FDR）。最后，以 |log2（FC）|＞1、FDR＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選NSCLC患者和健康志愿者外周血外泌體中表達(dá)差異的miRNAs。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，癌癥基因組圖譜（TCGA）中LUAD及LUSC的腫瘤組織與癌旁正常組織中miRNA-9-3p表達(dá)量的比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血外泌體中miRNAs測序結(jié)果 8個樣品共產(chǎn)生7 007兆堿基對（megabase pairs，Mbp）的數(shù)據(jù)量，每個樣品平均產(chǎn)生876 Mbp的數(shù)據(jù)量。去掉測序接頭污染和低質(zhì)量序列后每個樣品平均保留625 Mbp的數(shù)據(jù)量用于miRNAs分析。與miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，8個樣品檢測到200～1 048種miRNAs，其中4例NSCLC患者外周血外泌體中平均檢測到776種miRNAs，4例健康志愿者外周血外泌體中平均檢測到238種miRNAs，詳見表2。

2.2 外周血外泌體中差異基因分析結(jié)果 以|log2（FC）|＞1、FDR＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，與健康志愿者相比，LUAD患者外周血外泌體中共有53種差異表達(dá)的miRNAs（見圖1），LUSC患者外周血外泌體中共有62種差異表達(dá)的miRNAs（見圖2）。LUAD與LUSC患者外周血外泌體中差異表達(dá)最顯著的10種miRNAs中有6種是重合的，分別為miRNA-1228-5p、miRNA-129-5p、miRNA-760、miRNA-885-3p、miRNA-9-3p、miRNA-95-3p，詳見圖3。

2.3 篩選NSCLC患者特異性表達(dá)的miRNAs 通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，上述6種重合的miRNAs中僅miRNA-9-3p表達(dá)上調(diào)與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)［7］。通過比較4例NSCLC患者和4例健康志愿者外周血外泌體中miRNA-9-3p表達(dá)豐度發(fā)現(xiàn)，LUSC-1、LUSC-2、LUAD-1及LUAD-2樣品中miRNA-9-3p表達(dá)量分別為71.51、15.61、13.99、16.11 TPM，4例健康志愿者外周血外泌體中miRNA-9-3p表達(dá)量均為0。

2.4 TCGA中LUAD組織和LUSC組織與其配對的癌旁正常組織中miRNA-9-3p的表達(dá)差異 對TCGA中39對LUAD組織和配對的癌旁正常組織及45對LUSC組織和配對的癌旁正常組織中miRNA-9-3p測序數(shù)據(jù)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，LUAD組織和LUSC組織中miRNA-9-3p表達(dá)量分別高于其配對的癌旁正常組織（t值分別為 -4.272、-6.600，P＜0.01，見圖 4）。

表2 4例NSCLC患者和4例健康志愿者外周血外泌體miRNAs高通量測序結(jié)果Table 2 High-throughput sequencing results of miRNAs in peripheral blood exosomes in the 4 patients with NSCLC and the 4 healthy volunteers

圖1 LUAD患者和健康志愿者外周血外泌體中miRNAs差異表達(dá)的火山圖Figure 1 Volcano plot for differentially expressed miRNAs in peripheral blood exosomes in patients with LUAD and healthy volunteers

圖3 LUAD患者比健康志愿者與LUSC患者比健康志愿者外周血外泌體中差異表達(dá)最顯著的10種miRNAsFigure 3 The 10 miRNAs with the most significant expression difference in LUAD patients compared with healthy volunteers and LUSC patients compared with healthy volunteers

圖2 LUSC患者和健康志愿者外周血外泌體中miRNAs差異表達(dá)的火山圖Figure 2 Volcano plot for differentially expressed miRNAs in peripheral blood exosomes in LUSC patients and healthy volunteers

圖4 TCGA中LUAD組織和LUSC組織與其配對的癌旁正常組織中miRNA-9-3p的表達(dá)量比較的箱式圖Figure 4 Box diagram for comparison of expression quantity of miRNA-9-3p between LUAD tissues，LUSC tissues and the matched normal paracancerous tissues in TCGA

3 討論

本研究通過對4例NSCLC患者和4例健康志愿者外周血外泌體中miRNAs進(jìn)行高通量測序并產(chǎn)生了一批高質(zhì)量的miRNAs測序數(shù)據(jù)，之后將測序序列信息與miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)4例NSCLC患者外周血外泌體中平均檢測到776種miRNAs，多于4例健康志愿者的238種，與既往研究報道的癌癥患者血漿外泌體中miRNAs數(shù)量明顯多于正常人群相一致［8-9］。國外研究表明，與正常組織相比，腫瘤組織會釋放更多的外泌體到外周血中［10］，且該外泌體常攜帶特定的miRNAs并在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮信號溝通作用［11］，此外其還與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力和腫瘤微環(huán)境有關(guān)［12］。上述研究表明，NSCLC患者腫瘤組織釋放額外數(shù)量的外泌體可能攜帶來源于腫瘤細(xì)胞的特異性miRNAs，而通過分析外泌體特異性組成可能成為癌癥的輔助診斷工具。

本研究采用DESeq2軟件分析NSCLC患者和健康志愿者外周血外泌體中差異表達(dá)的miRNAs并發(fā)現(xiàn)LUAD與LUSC患者外周血外泌體中差異表達(dá)最顯著的10種miRNAs中有6種是重合的，提示該6種miRNAs可能是來源于NSCLC組織的特異性miRNAs；之后筆者通過檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，上述6種重合的miRNAs中僅miRNA-9-3p表達(dá)上調(diào)與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)，其可作為評估NSCLC患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物［7］。本研究結(jié)果顯示，4例NSCLC患者外周血外泌體中均可檢測到miRNA-9-3p的表達(dá)，而4例健康志愿者外周血外泌體中均未檢測到miRNA-9-3p的表達(dá)；為了證實外周血外泌體中miRNA-9-3p來源于NSCLC組織，筆者對TCGA中39對LUAD組織和配對的癌旁正常組織及45對LUSC組織和配對的癌旁正常組織中miRNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行對比并發(fā)現(xiàn)LUAD組織和LUSC組織中miRNA-9-3p表達(dá)量分別高于其配對的癌旁正常組織。

綜上所述，通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)miRNA-1228-5p、miRNA-129-5p、miRNA-760、miRNA-885-3p、miRNA-9-3p、miRNA-95-3p可能是NSCLC患者潛在的特異性miRNAs，其中miRNA-9-3p主要來源于NSCLC患者癌組織，這為后續(xù)通過外周血外泌體miRNAs測序而實現(xiàn)NSCLC的早期、無創(chuàng)診斷奠定了研究基礎(chǔ)；但本研究樣本量小，研究發(fā)現(xiàn)的6種潛在的特異性miRNAs在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚不清楚，因此下一步需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實NSCLC患者外周血外泌體中特異性miRNAs并通過生物功能學(xué)實驗深入探索其作用機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)：張婷進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析，數(shù)據(jù)的收集、整理、分析，結(jié)果分析與解釋，并負(fù)責(zé)撰寫論文；王凌偉負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。