梁龍兵， 林 香2， 喻時(shí)周， 皮明雪， 張敏琴， 王仙萍， 向 陽， 趙繼獻(xiàn)

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜研究所， 貴陽 550008； 2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025)

蕓薹屬(Brsssica species)是十字花科下非常重要的一個(gè)屬，具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，包括許多重要的油料、蔬菜和飼料作物。蕓薹屬栽培種即U氏三角中的6個(gè)種：3個(gè)二倍體基本種白菜型油菜(B.rapaL.或B.campestrisL.，AA，2 n=20)、甘藍(lán)(B.oleracea, CC，2 n=18)和黑芥(B.nigra(L.) Koch，BB，2 n=16)，3個(gè)四倍體復(fù)合種甘藍(lán)型油菜(B.napusL.，AACC，2 n=38)、芥菜型油菜(B.junceaL.，Czern & Coss, AABB，2 n=36)和埃塞俄比亞芥(B.carinataA.Braun, BBCC，2 n=34)[1]。甘藍(lán)型油菜起源于白菜型油菜和甘藍(lán)的自然雜交及染色體加倍[2]，是全世界栽培面積最為廣泛的栽培種，在過去的幾十年中，利用其它5個(gè)栽培種的一系列重要農(nóng)藝性狀極大地改良了甘藍(lán)型油菜[3]。

植物細(xì)胞質(zhì)DNA分布于線粒體和葉綠體中，由細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)決定，細(xì)胞質(zhì)基因與細(xì)胞核基因在遺傳表達(dá)中相互有信息交流[4-5]，通過核質(zhì)互作影響育性[6]，細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)對雜種優(yōu)勢的發(fā)揮也具有影響[7]。甘藍(lán)型油菜的長期育種選擇，使得遺傳基礎(chǔ)變窄，進(jìn)行蕓薹屬種間遠(yuǎn)緣雜交能有效拓寬油菜遺傳基礎(chǔ)，也是油菜品種改良的重要手段之一。長期的遠(yuǎn)緣雜交，甘藍(lán)型油菜具有來源于不同栽培種的細(xì)胞質(zhì)類型，因此準(zhǔn)確區(qū)分不同細(xì)胞質(zhì)類型對于油菜雜種優(yōu)勢的高效利用有著重要意義[8]。由于不同物種細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)存在差異，蕓薹屬6個(gè)栽培種細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型各異[9]。研究表明，蕓薹屬不同物種之間，如甘藍(lán)、芥菜型油菜、不同細(xì)胞質(zhì)類型的甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜及黑芥、埃塞俄比亞芥、蕓芥的葉綠體和線粒體基因存在較豐富的遺傳多樣性[13]，蕓薹屬栽培種內(nèi)如甘藍(lán)的細(xì)胞質(zhì)葉綠體基因也具有較高的多樣性[10-12]。針對蕓薹屬6個(gè)栽培種細(xì)胞質(zhì)的多樣性，可以利用分子標(biāo)記對不同來源的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行有效區(qū)分鑒定。本研究利用蕓薹屬栽培種的線粒體和葉綠體全基因組序列設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記，對來自不同地區(qū)39份蕓薹屬6個(gè)栽培種細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，為油菜材料創(chuàng)新以及雜種優(yōu)勢利用提供分子鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為39份源自國內(nèi)外的蕓薹屬不同栽培種細(xì)胞質(zhì)類型的種質(zhì)資源，其中白菜1份，黑芥1份，甘藍(lán)2份，埃塞俄比亞芥1份，甘藍(lán)型油菜26份，芥菜型油菜8份(表1)。

表1 供試材料信息

序號材料名稱細(xì)胞質(zhì)類型材料來源1GRB094白菜貴州省2GRB4107黑芥貴州省3GRA113甘藍(lán)貴州省411HB32甘藍(lán)型油菜四川省5GRB4106埃塞俄比亞芥四川省6Zhongshuang11甘藍(lán)型油菜中國農(nóng)科院油料所7GRB999甘藍(lán)型油菜貴州省8Xiangyou17甘藍(lán)型油菜湖南省9Chuanyou36甘藍(lán)型油菜四川省10Y335甘藍(lán)型油菜貴州省11Y336甘藍(lán)型油菜貴州省12D3361A甘藍(lán)型油菜貴州省13D3361甘藍(lán)型油菜貴州省14AB450甘藍(lán)型油菜澳大利亞15Liraglu甘藍(lán)型油菜澳大利亞1631048甘藍(lán)型油菜湖北恩施17Nabo甘藍(lán)型油菜法國18HJa82470甘藍(lán)型油菜芬蘭19Koolzaand甘藍(lán)型油菜荷蘭20Huayou-2H甘藍(lán)型油菜華中農(nóng)業(yè)大學(xué)21Canada-2H甘藍(lán)型油菜加拿大22TRIVMPH甘藍(lán)型油菜加拿大23P11甘藍(lán)型油菜捷克24Halleyuche甘藍(lán)型油菜南朝鮮25Dong-Hae23甘藍(lán)型油菜日本26Qinseng甘藍(lán)型油菜日本27SV.Juno甘藍(lán)型油菜瑞典28BF10(A)甘藍(lán)型油菜臺(tái)灣省29P4甘藍(lán)型油菜西德30Expander甘藍(lán)型油菜西德31Superlati-velot甘藍(lán)型油菜新西蘭32GRA093芥菜型油菜陜西33GRA094芥菜型油菜陜西34GRA096芥菜型油菜陜西35C30707芥菜型油菜貴州普安36C30854芥菜型油菜貴州安龍37C30947芥菜型油菜貴州平壩38C31085芥菜型油菜貴州織金39C31190芥菜型油菜貴州安順

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1引物信息

根據(jù)文獻(xiàn)資料[14-16]，針對葉綠體和線粒體中的目標(biāo)基因，利用39對特異性引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表2)。

1.2.2DNA的提取

每份材料于苗期隨機(jī)選取10株，采摘幼嫩葉片混合取樣，根據(jù)改良CTAB法提取油菜葉片細(xì)胞質(zhì)DNA[18]。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測質(zhì)量濃度后，將DNA樣品濃度稀釋至35 mg·μL-1，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR反應(yīng)

PCR檢測所用的反應(yīng)體系為10μL：其中模板2μL，正向引物和反向引物引物各0.5μL，TIANGEN公司的1× Taq buffer(已添加Mg+)1μL，dNTPs 0.2μL，Taq DNA聚合酶0.1μL, ddH2O 5.7μL。擴(kuò)增程序： 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸2 min。在PTC-225擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)總電壓為150 V，通常電泳1.5 h左右。擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(100 mL聚丙烯酰胺溶液中含7.6 g丙烯酰胺和0.4 g甲叉雙丙烯酰胺)上進(jìn)行電泳分離，然后進(jìn)行銀染，銀染方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版》進(jìn)行銀染，在凝膠自動(dòng)成像儀上觀察。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)電泳圖譜上有差異且易于識(shí)別的多態(tài)性條帶圖譜上有帶計(jì)為“1”，無帶計(jì)為“0”，多態(tài)性信息含量(PIC)計(jì)算公式為：

式中，pi表示第i個(gè)引物的等位位點(diǎn)頻率。用NTSYS-PC 2.10 e軟件包計(jì)算遺傳相似系數(shù)，獲得相似系數(shù)矩陣，用該軟件包的SHAN程序和UPGMA方法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞質(zhì)SSR標(biāo)記的多態(tài)性

對葉綠體、線粒體特異性引物在39份材料中的擴(kuò)增結(jié)果表明，篩選到11對多態(tài)性引物，從8對線粒體特異性引物中篩選得到2對具有多態(tài)性的引物，這些多態(tài)性引物共檢測到38條多態(tài)性帶，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因?yàn)?～6個(gè)，平均為3個(gè)，多態(tài)性信息量PIC值為0.10～0.76，平均為0.39(表3)，多態(tài)性信息量衡量基因變異程度高低，當(dāng)PIC≥0.5 時(shí)，該引物為高度多態(tài)性信息引物，當(dāng) 0.25≤PIC<0.5 時(shí)為中度多態(tài)性信息引物，當(dāng)PIC<0.25 時(shí)為低度多態(tài)性信息引物。11對多態(tài)性引物中有5對引物為高度多態(tài)性信息引物，其中包含2對線粒體引物，表明該5個(gè)特異性引物能較好地鑒別6個(gè)蕓薹屬栽培種。

葉綠體特異性引物PsbB-PsbT檢測3個(gè)多態(tài)性類型(圖1 A)，在甘藍(lán)型、芥菜型油菜栽培種內(nèi)均有多態(tài)性，其中日本與朝鮮甘藍(lán)型油菜在片段270 bp、320 bp同時(shí)出現(xiàn)2個(gè)多態(tài)類型，表明不能完全區(qū)分2種蕓苔屬栽培種。圖1 B為線粒體引物BnTR 1可得3個(gè)多態(tài)性類型(圖1 B)，在甘藍(lán)型、芥菜型油菜栽培種內(nèi)均有2種多態(tài)類型。其中加拿大、捷克甘藍(lán)型油菜出現(xiàn)多態(tài)性，貴州安順與織金出現(xiàn)多態(tài)類型。其余11對線粒體、葉綠體引物均不能單獨(dú)區(qū)分6個(gè)栽培種。在11對葉綠體特異性引物PsbB-PsbT檢測多態(tài)性，PIC最高，為0.74，兩對特異的線粒體SSR標(biāo)記BnTR 1和BnTR 4中均檢測到多態(tài)性，多態(tài)性條帶分別為3和4，PIC值分別為0.5和0.76。

表2 葉綠體與線粒體多態(tài)性引物的名稱、序列

引物名稱細(xì)胞器類型 引物序列(F)引物序列(R)ccmp2葉綠體GATCCCGGACGTAATCCTGATCGTACCGAGGGTTCGAATccmp3葉綠體CAGACCAAAAGCTGACATAGGTTTCATTCGGCTCCTTTATtrnL-F葉綠體TCAATTGCACATTCTAGAATTCTAAGCAATTCAATATGGTTATATATTAGAG rpl16葉綠體GGTTCCGTCGTTCCCATCGCCATAATAATTAGATAAATCTGTTCCtrnE-trnT葉綠體AATGGTATGACTAGCTTATAAGGCTTAACAATGAGATGAGGCAATCpsaA-ycf3葉綠體CGGATCTATTATGACATATCCGAAATATGAATACACTAGATTAGGtrnT-rpoC2葉綠體CCTGGCGGTATCAAGATGCCACTGCCATAATGGTACAGAACTATatpB-rbcL葉綠體GAAGGAATAGTCGTTTTCAAGCATAAATAGAGTTCCATTTCGGTrnM-atpE葉綠體CGGCAGGAGTCATTGGTTCAAAGATTTTGTAACTAGCTGACGrbcL-accD葉綠體CTTATATTCATAAGCGAAGAACAATAACAATAGATGAATAGTCAndhB-rps7葉綠體GGGCCGTTATGCTCATTACG TCCTATTCATGGGGATTCCGCh35葉綠體TGGAAAAGGGGAGTTGTCCGGAATATTACTCTCGAACAGACCh39葉綠體CATGAATTAGTAACTGCATCCTCCTATTCATGGGGATTCCGACP2葉綠體GAAAAATGCAAGCACGGTTTTACGATCCGTAGTGGGTTGCACP4葉綠體TACCCGTATTAGGCACTATTTGTAAGACCACGACTGACP35葉綠體ATTGGCTTACTTCTTGCGGGTTTCCGGGATGTTATTACP38葉綠體GGTTCGTTAGCAGGTTTAGTTCCCTAGCAACACTTTACP47葉綠體TGTACTTATGGGAAAGCGCTGGGTTCTTCTACTTCATTTrnK 葉綠體TCAAATGATACATAGTGCGATACA AATAAAGGATTTCTAACCATCTT TrnQ-TrnS 葉綠體AATCCTGGACGTGAAGAATAA AATCCCTCTCTTTCCGTTGA TrnG 葉綠體CCAAAAGCTGACATAGATGTTA TTTCATTCGGCTCCTTTATG Rps2-RpoC2 葉綠體TCTGATAAAAAACGAGCAGTTCT GAGAAGGTTCCATCGGAACAA Ycf3 葉綠體TTGATCTTTACGGTGCTTCCTCTA TCATTACGTGCGACTATCTCC AtpB-RbcL 葉綠體TCTAGGATTTACATATACAACAT CATCATTATTGTATACTCTTTCA PsbB-PsbT葉綠體CCAAAAACTTGGAGATCCAACTAC TTCCATAGATTCGATCGTGGTTTA ACP1葉綠體GAACGACGGGAATTGAACCGGTGGAATTTGCTACCTTTTTACP10葉綠體GTATTAAATCCGAAACTCACTTGACATAAAACTTGGACP20葉綠體CTCAACCGCCATCATACTCGAAACTTAACCCTCTTTACP29葉綠體GGCCATAGGCTGGAAAGTCTGTTTATGCATGGCGAAAAGGACP33葉綠體AGGGATAGTAATAAGAATAGCAGATGTAAGAACGAAAAACP39葉綠體AGACGGGTGAATAGAGTGGTTATGCTTTTCGACGATatp6線粒體GATTTATAGCATCATTCAAGTAAATACAGGAATCAAATAGGGCTGGTGGorf474線粒體GAATCAAATAGGGCTGGTGGCGGAGCTCCCCGGCAGTCAACCAAGAAAGBnTR1線粒體CCGTTAGGGGTATTTAGTAACTCGACATAATGGCAATGTATCGGACTGBnTR2線粒體TGATAACAGTTTCCTCCTAGTTTGCGAACCTGTTAATTAGCACGGAACTABnTR3線粒體GAGTGCTGGCTGTTATAGTATGGTTATAGGAACAGAAAGCTACGCTAACAABnTR4線粒體GAAGTCCGAGGACCTTTAGTACCAGTAAGTTGTAGGTAGGGGCTTCATBnTR5線粒體CTTACAGTCGAGCTCCTTTGTCACTGTAACTCGACCCCTCATCAACTAATBnTR6線粒體AGTATATTGACAGTGCCCCAAGACAGTTACTCGACTGAAAAGGAGAGGT

注：圖中M為Maker，A、B分別是引物PsbB-PsbT、BnTR1。圖1 線粒體葉綠體引物在39份材料中的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 39份材料的遺傳聚類結(jié)果

2.2 聚類分析

將所有SSR標(biāo)記結(jié)果合并，計(jì)算39份材料間的遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)平均法(UPGMA) 對全部參試材料進(jìn)行聚類分析，得到的遺傳聚類圖(圖2)。結(jié)果顯示39份材料的遺傳相似系數(shù)為0.32～1.00。在遺傳相似系數(shù)0.71處，39份材料可明顯分為6類，與供試材料的分類基本一致，由此表明本研究所設(shè)計(jì)的標(biāo)記引物能夠有效區(qū)分蕓薹屬6個(gè)栽培種的細(xì)胞質(zhì)類型，黑芥與其他5個(gè)栽培種遺傳距離最遠(yuǎn)，甘藍(lán)型油菜11 HB 32與甘藍(lán)分為一類。在0.75處甘藍(lán)型油菜分為兩大類，來自捷克與南朝鮮為一類，其余25份為一類，0.94～0.98處，甘藍(lán)型油菜具有較豐富多樣性。在0.89處芥菜型油菜分為兩類，貴州織金與安順為一類，其余六份為一類。

表3 多態(tài)性引物的名稱、序列、等位基因數(shù)及多態(tài)性信息含量

引物名稱等位基因長度等位基因數(shù)PICccmp2200～30030.24trnL-F200～25020.10rpl16150～20020.47trnE-trnT285～31530.50ACP2100～15030.47ACP4150～20020.15ACP35250～30020.10ACP38250～30020.19ACP47295～31530.48ACP29255～41060.69PsbB-PsbT260～32030.74BnTR1150～20030.50BnTR4230～26040.76

3 討 論

本研究從不同國家，不同地區(qū)200份栽培種篩選出39份具有代表性和遺傳多樣性蕓薹屬栽培種，其鑒定引物序列來自于國內(nèi)外分子育種研究者報(bào)道[15-16]，具有豐富的多態(tài)性，利用31對葉綠體和8對線粒體SSR分別篩選到11和2對穩(wěn)定且多態(tài)性好SSR引物，能較好的區(qū)分6個(gè)栽培種，這與張瑞杰等[13]的研究結(jié)果相似。由于2對引物在鑒別蕓薹屬中明顯呈現(xiàn)5個(gè)單倍型[19]，在13對線粒體特異性引物中，只有BnTR 1、BnTR 4出現(xiàn)高度多態(tài)性。

葉綠體、線粒體基因在甘藍(lán)型油菜與芥菜型油菜均有多樣性，表明除了細(xì)胞核基因以外細(xì)胞質(zhì)基因組也有多樣性，這為蕓薹屬栽培種分類提供了新方法。目前對油菜品種鑒定均引用核基因組SSR分子標(biāo)記，尚未利用葉綠體、線粒體分子標(biāo)記對作物品種進(jìn)行登記或者認(rèn)定，本研究的方法可使后續(xù)的理論研究和實(shí)際生產(chǎn)提供新技術(shù)。目前對植物細(xì)胞質(zhì)鑒定未見報(bào)道，國內(nèi)外研究者對蕓薹屬栽培種相互間作種的遠(yuǎn)緣雜交，使其后代細(xì)胞質(zhì)基因組較為混亂，出現(xiàn)各種敗育類型，部分不育系統(tǒng)核質(zhì)互作找到恢復(fù)源，使得其可利用雜種優(yōu)勢，部分胞質(zhì)不育出現(xiàn)微粉，可能細(xì)胞質(zhì)基因組相互間排斥或出現(xiàn)變異，或其他可能，這使得鑒定細(xì)胞質(zhì)極為必要，以便更好研究雜種優(yōu)勢在細(xì)胞質(zhì)的分子機(jī)理。本研究利用蕓薹屬6個(gè)基本種39份材料，除了27份甘藍(lán)型油菜，芥菜型油菜8份，其他栽培種白菜型油菜1份，甘藍(lán)1份，黑芥1份，埃色俄比亞芥1份，樣本量少，未知其他栽培種內(nèi)遺傳多樣性，可望后續(xù)研究中對其他栽培種進(jìn)行種內(nèi)胞質(zhì)鑒定。