沈艷 李沛明 孫如意

摘要 [目的]評(píng)價(jià)5種稻田除草劑（37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑、20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑、30%五氟磺草胺·吡嘧磺隆·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑）對(duì)羊角月芽藻生長(zhǎng)的抑制作用。[方法]參照《農(nóng)化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》，分別測(cè)定5種供試藥劑對(duì)羊角月芽藻生物量增長(zhǎng)的抑制率和生長(zhǎng)率的抑制率，計(jì)算半效應(yīng)濃度EyC50和ErC50。[結(jié)果]37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑對(duì)羊角月芽藻表現(xiàn)為低毒;20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯、30%五·吡·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑對(duì)羊角月芽藻均表現(xiàn)中高毒性，對(duì)綠藻存在較大風(fēng)險(xiǎn)。[結(jié)論]稻田高毒除草劑在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)嚴(yán)格控制用量，盡量減小其對(duì)綠藻及水生態(tài)系統(tǒng)造成危害。

關(guān)鍵詞 稻田除草劑;羊角月芽藻;生物量增長(zhǎng)抑制;生長(zhǎng)率抑制

中圖分類號(hào) S482.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）19-0148-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.043

Abstract [Objective] To evaluate the growth inhibition of five paddy herbicides on Pseudokirchneriella subcapitata. [Method] The inhibition rate of the yield and average growth rate of five paddy herbicides on? P. subcapitata were determined， and the median effective concentration EyC50 and ErC50 were calculated referring to Test Guidelines on Environmental Safety Assessment for Chemical Pesticides. [Result] The acute toxicity of MCPANa·bentazone on Pseudokirchneriella subcapitata was low toxic;the acute toxicity of penoxsulam·pyrazosulfuronethyl·pretilachlor， pyribenzoxim·cyhalofopbutyl and oxadiargyl were? midhigh toxic， and they were higher risk to green algae. [Conclusion] The dosage of these paddy hightoxic herbicides should be strictly controlled to minimize their harm to the green algae and water ecosystem.

Key words Paddy herbicides;Pseudokirchneriella subcapitata;Biomass growth inhibition;Growth rate inhibition

除草劑是化學(xué)農(nóng)藥中非常重要的一員，據(jù)報(bào)道，2015年農(nóng)藥登記產(chǎn)品共計(jì)3 295個(gè)，其中除草劑934個(gè)，占比283%;2015年全國(guó)農(nóng)藥總產(chǎn)量132.8萬(wàn)t，其中除草劑82.7萬(wàn)t，占比62.3%[1]。水稻是我國(guó)重要的糧食作物之一，稻田中雜草的防治目前仍主要依靠化學(xué)防治，稻田除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。暴露于環(huán)境中的除草劑很大一部分可通過(guò)土壤浸出、降雨沖刷、地表徑流等途徑進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)，不僅污染水環(huán)境，還對(duì)非靶標(biāo)生物產(chǎn)生潛在毒性[2-3]。

藻類是水生系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，為浮游無(wú)脊椎動(dòng)物、魚類等高等水生生物提供氧氣和食物，在水生生態(tài)系統(tǒng)中具有至關(guān)重要的地位[4]。同時(shí)藻類具有個(gè)體小、繁殖快、易獲得等特點(diǎn)，且對(duì)有毒物質(zhì)敏感性高[5-7]，因此廣泛應(yīng)用于化學(xué)品、污染物和各種農(nóng)藥對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)影響的毒理學(xué)研究[8]。而除草劑對(duì)藻類的毒性作用最強(qiáng)，其毒性效應(yīng)遠(yuǎn)高于殺蟲劑和殺菌劑[1]。

目前很多研究者進(jìn)行除草劑對(duì)藻類的毒性研究[9-12]，但多數(shù)以原藥或單劑為主。筆者選用37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑、20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑、30%五氟磺草胺·吡嘧磺隆·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑5種稻田除草劑（其中2種單劑、3種復(fù)配劑），研究其對(duì)羊角月芽藻的生長(zhǎng)抑制影響，旨在為稻田除草劑安全合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)生物

羊角月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)。選用BG11培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，溫度（23±1）℃，光照時(shí)間16 h/8 h，光強(qiáng)4 440～8 880 lx。試驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，每隔96 h轉(zhuǎn)接一次，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，使綠藻處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2 試驗(yàn)藥劑

37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑、20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑、30%五氟磺草胺·吡嘧磺隆·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所提供。99.8%重鉻酸鉀由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

二甲四氯標(biāo)準(zhǔn)品純度99.2%，由安徽豐樂(lè)農(nóng)化有限責(zé)任公司提供;滅草松標(biāo)準(zhǔn)品純度98.48%，由江蘇激素研究所提供;嘧啶肟草醚標(biāo)準(zhǔn)品純度99%，由德國(guó)Dr.提供;氰氟草酯標(biāo)準(zhǔn)品純度96.5%，由黃山農(nóng)化有限公司提供;五氟磺草胺標(biāo)準(zhǔn)品純度97%，由青島農(nóng)冠農(nóng)藥有限責(zé)任公司提供;吡嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)品純度98.3%，由上海農(nóng)藥研究所提供;丙草胺標(biāo)準(zhǔn)品純度98.1%，由山東濱農(nóng)科技公司提供;丙炔噁草酮標(biāo)準(zhǔn)品純度96.5%，由黑龍江綠豐源生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器設(shè)備

智能人工氣候箱、光學(xué)顯微鏡、紫外分光光度計(jì)、超凈工作臺(tái)、萬(wàn)分之一電子天平、高壓滅菌鍋、移液器、島津LC-20AT高效液相色譜儀、島津液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀LCMS-8030、島津GC-2010氣相色譜儀（ECD檢測(cè)器）、Agilent GC 7890A氣相色譜儀（ECD檢測(cè)器）、Agilent 1200高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、HC-3018高速離心機(jī)、便攜式pH計(jì)、光照計(jì)、電子溫濕度計(jì)等。

1.4 試驗(yàn)方法

參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[13]，分別用5種供試藥劑進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以較大的間距設(shè)置4個(gè)濃度組，得出供試藥劑對(duì)羊角月芽藻生長(zhǎng)受抑制的最低濃度和不受抑制的最高濃度;然后在此濃度范圍內(nèi)，分別以一定的比例間距（幾何級(jí)差控制在3.2倍以內(nèi)）設(shè)置7個(gè)濃度組，進(jìn)行正式試驗(yàn)。分別取50 mL 配制好的試驗(yàn)藥液，倒入250 mL 三角瓶中;再加入藻細(xì)胞密度在1.0×105個(gè)/mL的羊角月芽藻50 mL，使得初始藻種密度控制在5.0×104個(gè)/mL左右，搖勻后用封口膜封口，隨機(jī)放入智能人工氣候箱。每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)重復(fù)。同時(shí)以滅菌水加藻液作為空白對(duì)照。每天定時(shí)人工搖動(dòng)5～8次。試驗(yàn)開(kāi)始后每隔24 h取樣，用血球計(jì)數(shù)板準(zhǔn)確計(jì)數(shù)藻細(xì)胞個(gè)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，同時(shí)觀察藻細(xì)胞顏色形態(tài)以及是否黏連或聚結(jié)等現(xiàn)象。試驗(yàn)調(diào)查持續(xù)72 h。試驗(yàn)開(kāi)始后分別在0和72 h留取各濃度組試驗(yàn)藥液樣品，檢測(cè)分析試驗(yàn)藥液的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)試驗(yàn)期間觀察記錄的數(shù)據(jù)，分別計(jì)算不同濃度組羊角月芽藻生物量增長(zhǎng)抑制百分率和生長(zhǎng)率增長(zhǎng)抑制百分率。處理組藻生物量增長(zhǎng)的抑制百分率按公式（1）計(jì)算：

Iy=Yc-YtYc×100%（1）

式中，Iy為處理組生物量增長(zhǎng)的抑制百分率（%）;Yc為空白對(duì)照組測(cè)定的藻類單位生物量，用細(xì)胞數(shù)表示時(shí)單位為個(gè)/mL;Yt為處理組測(cè)定的藻類單位生物量，用細(xì)胞數(shù)表示時(shí)單位為個(gè)/mL。

處理組藻類生長(zhǎng)率抑制百分率按公式（2）計(jì)算：

Ir=μc-μtμc×100%（2）

式中，Ir為處理組藻類生長(zhǎng)率的抑制百分率，%;μc為空白對(duì)照組生長(zhǎng)率的平均值;μt為處理組生長(zhǎng)率平均值。其中μ按公式（3）計(jì)算：

μj-i=lnXj-lnXitj-ti（3）

式中， μj-i為在時(shí)間點(diǎn)i時(shí)間點(diǎn)j之間的平均生長(zhǎng)率;Xi為在時(shí)間點(diǎn)i時(shí)的藻類單位生物量，用細(xì)胞數(shù)表示時(shí)單位為個(gè)/mL;Xj為在時(shí)間點(diǎn)j時(shí)藻類單位生物量，用細(xì)胞數(shù)表示時(shí)單位為個(gè)/mL。

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0進(jìn)行分析，通過(guò)藻生物量增長(zhǎng)的抑制百分率和生長(zhǎng)率抑制百分率，得到5種供試藥劑對(duì)羊角月芽藻半效應(yīng)濃度72 h-EyC50 和72 h-ErC50、毒力回歸方程以及各自的95%置信區(qū)間。

1.6 供試藥劑對(duì)綠藻的毒性判定

試驗(yàn)結(jié)果的毒性等級(jí)均參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》進(jìn)行劃分，劃分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 參比試驗(yàn)結(jié)果

為了解選用的羊角月芽藻的生長(zhǎng)狀況及敏感性，試驗(yàn)之前用重鉻酸鉀進(jìn)行綠藻參比試驗(yàn)。重鉻酸鉀對(duì)羊角月芽藻的參比試驗(yàn)結(jié)果顯示，其半效應(yīng)濃度72 h-EyC50為0.077 mg/L，95%置信限為0.062～0.095 mg/L;72 h- ErC50為0.353 mg/L，95%置信限為0.271～0.487 mg/L。以此作為參考。

2.2 綠藻細(xì)胞毒性反應(yīng)

用光學(xué)顯微鏡觀察試驗(yàn)期間羊角月芽藻的毒性反應(yīng)。綠藻毒性反應(yīng)癥狀主要表現(xiàn)：藻細(xì)胞分解抱團(tuán)，部分呈絮狀，藻細(xì)胞明顯變小，且有斷裂、黏連等現(xiàn)象。高濃度組的藻細(xì)胞癥狀出現(xiàn)較早;低濃度組試驗(yàn)初期癥狀不明顯，隨著藥劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)，毒力效應(yīng)也逐漸增強(qiáng)，癥狀逐漸明顯。

2.3 供試物水樣濃度

5種除草劑的水樣濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的變化在±20%范圍內(nèi)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)濃度與初始濃度的變化在±10%范圍內(nèi)，說(shuō)明5種除草劑產(chǎn)品在試驗(yàn)體系中較穩(wěn)定，因此采用理論濃度計(jì)算半效應(yīng)濃度及其95%置信區(qū)間。

2.4 5種除草劑對(duì)羊角月芽藻生物量增長(zhǎng)的抑制效果

于試驗(yàn)開(kāi)始后24、48、72 h取樣，在光學(xué)顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算藻細(xì)胞數(shù)。72 h時(shí)5種稻田除草劑對(duì)羊角月芽藻生物量增長(zhǎng)的抑制情況見(jiàn)表2。根據(jù)5種稻田除草劑對(duì)羊角月芽藻生物量增長(zhǎng)的抑制率，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0分別分析半抑制效應(yīng)結(jié)果EyC50，結(jié)果見(jiàn)表3。37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑、20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑、30%五氟磺草胺·吡嘧磺隆·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑5種藥劑對(duì)羊角月芽藻的半抑制效應(yīng)結(jié)果EyC50分別為10.040、0.123、0.059、0002、0.003 mg/L。根據(jù)5種藥劑對(duì)綠藻生物量增長(zhǎng)的抑制情況，37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑表現(xiàn)為低毒，其他4種除草劑表現(xiàn)為高毒。

2.5 5種除草劑對(duì)羊角月芽藻生長(zhǎng)率的抑制效果

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組綠藻的羊角月芽藻細(xì)胞密度達(dá)1.35×106個(gè)/mL，比試驗(yàn)初始濃度增加了26倍。各濃度組羊角月芽藻的平均生長(zhǎng)率，5種藥劑對(duì)羊角月芽藻生長(zhǎng)率的抑制百分率（72 h）見(jiàn)表2。用SPSS 20.0分別分析半抑制效應(yīng)結(jié)果ErC50，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑、20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑、30%五氟磺草胺·吡嘧磺隆·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑5種藥劑對(duì)羊角月芽藻的半抑制效應(yīng)結(jié)果EyC50分別為48.445、1.317、0.144、0.008、0.008 mg/L。根據(jù)5種藥劑對(duì)綠藻生長(zhǎng)率的抑制情況，375%二甲四氯鈉·滅草松水劑表現(xiàn)為低毒，20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑為中等毒性，其他3種除草劑表現(xiàn)為高毒。

3 結(jié)論與討論

藻類是水生系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，藻類生物量和群落結(jié)構(gòu)的變化會(huì)影響水生系統(tǒng)生物鏈的更高營(yíng)養(yǎng)級(jí)，如食草浮游動(dòng)物和魚類[3，14]。對(duì)藻類的危害將影響整個(gè)水生生態(tài)鏈，甚至通過(guò)食物鏈影響人類的健康[4]。稻田除草劑作為可直接污染水體的重要來(lái)源，其安全合理使用日益受到重視[11]。

該研究選擇5種用于直播水稻田或移栽水稻田的除草劑制劑對(duì)羊角月芽藻進(jìn)行生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明，除375%二甲四氯鈉·滅草松水劑對(duì)藻類是低毒外，其他4種藥劑對(duì)綠藻均表現(xiàn)為中高毒性，尤其是2個(gè)丙炔噁草酮制劑，EyC50為0.002～0.003 mg/L，遠(yuǎn)低于0.3 mg/L的高等毒性等級(jí)節(jié)點(diǎn)，對(duì)綠藻存在較大風(fēng)險(xiǎn)。

目前除草劑對(duì)藻類的毒性研究，多數(shù)以原藥或單劑為主，而實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中則多為除草劑制劑。原藥對(duì)綠藻的研究?jī)H能反映有效成分本身對(duì)綠藻的毒性，無(wú)法綜合評(píng)估添加助劑等后的制劑產(chǎn)品對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的實(shí)際影響。目前已有多篇關(guān)于殺蟲劑對(duì)非靶標(biāo)動(dòng)物的毒性研究，與原藥相比制劑對(duì)供試生物的毒性更高，如20%丁硫克百威乳油制劑對(duì)土壤中蚯蚓死亡率的影響高于原藥[15];50%二嗪磷乳油和10%二嗪磷顆粒劑對(duì)鵪鶉和鷓鴣的毒性均比原藥毒性高[16];阿維菌素等8種殺蟲劑原藥對(duì)家蠶的LC50 均大于其制劑的LC50[17]。陳兆杰等[11]比較了3種水稻除草劑及其原藥對(duì)斑馬魚和羊角月芽藻的急性毒性，結(jié)果表明制劑的毒性普遍高于原藥。因此除草劑的毒性研究也應(yīng)注意原藥和制劑的比較，多關(guān)注制劑的毒性。

2018年我國(guó)水稻田除草劑登記產(chǎn)品總計(jì)484個(gè)，其中單劑272個(gè)，復(fù)配混劑212個(gè)[18]，復(fù)配劑占比43.8%。多數(shù)復(fù)配混劑以高效、低毒、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，成為農(nóng)藥登記的熱點(diǎn)。但該研究中3個(gè)復(fù)配劑只有37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑對(duì)藻類表現(xiàn)為低毒，另外2個(gè)均為中高毒。因此，除草劑復(fù)配劑對(duì)水生生物的毒性風(fēng)險(xiǎn)也不容忽視。

該研究是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的，稻田除草劑在田間實(shí)際施用時(shí)，其對(duì)水生系統(tǒng)的影響更為復(fù)雜，不僅包括其在自然環(huán)境中降解產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的毒性效應(yīng)[19-20]，還存在殺蟲劑、殺菌劑等多種類型農(nóng)藥共存的現(xiàn)象，使得除草劑對(duì)藻類及水生系統(tǒng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估難度更大。因此，稻田除草劑在使用時(shí)應(yīng)注意劑型的選擇，盡量選擇低毒除草劑;對(duì)于高效高毒除草劑應(yīng)嚴(yán)格控制用藥量，盡量減少其對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的影響。

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