張玉苗 李蓉 魯瑤 林玉玲 賴鐘雄 徐涵

摘 ?要??CRISPR基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，為功能基因的研究及遺傳改良提供了技術(shù)支持。提高基因組編輯效率成為使用基因編輯技術(shù)的基本點(diǎn)，目前已取得了重要進(jìn)展。本文結(jié)合CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用原理、晶體結(jié)構(gòu)，著重介紹目前提高編輯效率的最新研究進(jìn)展，對(duì)CRISPR/Cas基因編輯效率的提高進(jìn)行分析并提出改進(jìn)策略。

關(guān)鍵詞 ?CRISPR/Cas;基因組編輯;基因編輯效率中圖分類號(hào)??Q943.2??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Research Progress on Improving CRISPR/CasGenome Editing Efficiency

ZHANG Yumiao¹， LI Rong²， LU Yao²， LIN Yuling²， LAI Zhongxiong^2*， XUHAN Xu^2，3*

1. College of Biological and Environmental Engineering /?Shandong Key Laboratory of Eco-Environmental Science for the Yellow River Delta， Binzhou University， Binzhou， Shandong?256600， China; 2. Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian?350002， China; 3. Institut de la Recherche Interdisciplinaire de Toulouse， IRIT-ARI， Toulouse 31300， France

Abstract ?CRISPR genome editing technology has developed rapidly and provided technical support for the functional genes research and genetic improvement. High efficiency of genome editing is critical for the application of the technology， and important progresses have been made recently. The present review summarized historic events in the improvement of the technology especially of the editing efficiency in relation to the functional mechanism and structure of the CRISPR/Cas system， and proposed several technological hints to the improvement of the editing efficiency.

Keywords ?CRISPR/Cas; genome editing;?genome editing efficiency

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.013

基因工程，特別是轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)，對(duì)人類的福祉和安全帶來機(jī)遇和挑戰(zhàn)，堅(jiān)守生物安全底線早已經(jīng)是國際社會(huì)的共識(shí)^[1]，而生物安全的前提是基因工程技術(shù)的精準(zhǔn)、高效和可控。目前基因測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展使很多物種的全基因組序列得到展現(xiàn)。為揭示各基因的功能，對(duì)基因序列進(jìn)行精準(zhǔn)而有效的編輯是實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)直接和有效的方法?；蚓庉嫞╣ene editing/ genome editing），不僅有利于基因功能的研究，而且對(duì)植物的遺傳育種具有重大意義。本文主要通過對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的技術(shù)原理、晶體結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，同時(shí)綜合前人對(duì)編輯效率提高的研究，以期為提高基因編輯效率提供參考。

1 ?CRISPR/Cas技術(shù)的發(fā)現(xiàn)

現(xiàn)有的基因編輯系統(tǒng)主要包括鋅指核酸酶（zinc?finger?nucleases， ZFNs）系統(tǒng)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，?TALENs）系統(tǒng)以及CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein）系統(tǒng)^[2-3]。ZFN和TALEN技術(shù)均依賴蛋白質(zhì)對(duì)DNA序列的特異性識(shí)別，載體組裝的復(fù)雜性是它們?cè)诨蚓庉嬛袘?yīng)用的主要障礙。2013年，CRISPR/Cas[成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/associated protein]技術(shù)作為第三代基因組編輯技術(shù)迅速發(fā)展起來^[4-5]。CRIPSR/Cas體系普遍存在于細(xì)菌中，是細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫體系，可使細(xì)菌高效辨認(rèn)和切割入侵的外源核酸。CRISPR/Cas體系可將外源DNA片斷捕獲并將其插入到細(xì)菌基因組CRISPR-array中，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生向?qū)RISPR/RNA（crRNA）后，進(jìn)而引導(dǎo)Cas核酸內(nèi)切酶切割入侵外源核酸。CRISPR/Cas系統(tǒng)包含3種類型：I型，II型和III型;I型和III型系統(tǒng)較為復(fù)雜，需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合物開展切割;而II型系統(tǒng)僅需要一個(gè)Cas蛋白即可對(duì)外源核酸進(jìn)行更高效、特異的切割，成為基因編輯工具的最佳選擇^[6]。

隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術(shù)編輯效率（脫靶效應(yīng)、蛋白切割效率以及遞送方法）的問題亟待解決。

2??CRISPR/Cas系統(tǒng)的技術(shù)原理

目前廣泛應(yīng)用的Cas9蛋白屬于基因編輯的第二類系統(tǒng)^[7]，Cas12a（Cpf1），Cas13a（C2c2）等其他類型的Cas蛋白也相繼被發(fā)現(xiàn)^[8-9]，進(jìn)一步豐富了CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中幾個(gè)基因編輯系統(tǒng)的基礎(chǔ)信息見表1。在多樣性自然進(jìn)化系統(tǒng)中這種固有的可編程性的存在，使CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用擴(kuò)展到了精確的基因組編輯領(lǐng)域^[10-11]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)中Cas9核酸酶發(fā)揮作用，引導(dǎo)RNA（sgRNA）需要crRNA和tracrRNA形成復(fù)合體才能引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別靶位點(diǎn)，然后蛋白的2個(gè)核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域分別對(duì)DNA的2條單鏈進(jìn)行特異性切割^[12];Cas9核酸內(nèi)切酶對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別切割依賴靶序列3′端的PAM序列。不同的Cas9核酸內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的PAM序列亦不同，例如：spCas9核酸內(nèi)切酶PAM序列為“NGG”^?[12]，而saCas9核酸內(nèi)切酶PAM序列為（NNGRRT）^[13]。

CRISPR/Cas12a系統(tǒng)發(fā)揮切割作用的核酸內(nèi)切酶Cas12a（Cpf1）與Cas9蛋白相比，具備以下特點(diǎn)：（1）CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的引導(dǎo)RNA不需要tracrRNA，只需要crRNA即可發(fā)揮作用，Cas12a-crRNA復(fù)合體較小，進(jìn)入細(xì)胞或組織更加容易;（2）核酸內(nèi)切酶切割位置距離DNA靶點(diǎn)較遠(yuǎn)，在編輯位點(diǎn)上為基因組DNA編輯提供了更多選擇;（3）與Cas9切割雙鏈DNA產(chǎn)生的缺口是平末端，Cas12a切割產(chǎn)生的缺口是黏性末端，此末端更易于DNA的插入^[6]。

CRISPR/Cas13a系統(tǒng)發(fā)揮切割作用的核酸內(nèi)切酶為Cas13a（C2c2）蛋白，包含2個(gè)高等真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有RNA介導(dǎo)的RNA酶切割活性，可以切割單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）^[14]。相比Cas9和Cas12a，Cas13a核酸內(nèi)切酶使CRISPR系統(tǒng)在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用領(lǐng)域更為廣闊。

3??CRISPR/Cas系統(tǒng)的晶體結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)決定生物功能，因此要想充分研究CRISPR/Cas系統(tǒng)的功能以及存在的問題，就需要對(duì)其結(jié)構(gòu)有更清楚的了解，解析CRISPR/Cas系統(tǒng)的晶體結(jié)構(gòu)以期找到限制CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)展的關(guān)鍵因素。

3.1Cas9蛋白的晶體結(jié)構(gòu)

科研工作者目前已對(duì)SpCas9蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，研究發(fā)現(xiàn)SpCas9蛋白由1368個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包括REC-lobe和NUC-lobe 2個(gè)葉片狀（lobe）結(jié)構(gòu)（圖1A）分別負(fù)責(zé)靶DNA的識(shí)別以及剪切工作;REC-lobe包括REC1、REC2以及1個(gè)長的α螺旋區(qū)域3個(gè)結(jié)構(gòu)域，NUC-lobe包括RuvC、HNH以及PI（PAM interaction，PI）3個(gè)結(jié)構(gòu)域;另外，RuvC結(jié)構(gòu)域可與PI結(jié)構(gòu)域相互作用，形成一個(gè)可與sgRNA發(fā)生相互作用的帶正電荷的表面^[15-16]。REC-lobe和NUC-lobe間可形成帶正電荷的凹槽，在此凹槽內(nèi)，SpCas9、sgRNA和靶DNA3者可以相互作用，完成對(duì)雙鏈DNA的切割;在相互作用的過程中，首先REC-lobe與sgRNA結(jié)合，2者協(xié)同作用在靶DNA上尋找PAM序列;然后，sgRNA與靶DNA上的堿基互補(bǔ)配對(duì)，REC-lobe完成了對(duì)靶DNA的識(shí)別;接著，NUC-lobe中的RuvC和HNH結(jié)構(gòu)域分別對(duì)靶DNA的2條鏈進(jìn)行切割，完成NUC-lobe對(duì)靶DNA的剪切功能（圖1B）。SpCas9蛋白單獨(dú)存在是無活性的，當(dāng)其與sgRNA結(jié)合后，SpCas9蛋白的構(gòu)象會(huì)發(fā)生巨大的變化，處于活性狀態(tài)，完成對(duì)靶DNA的切割^[15-16]。

3.2 Cas12a（Cpf1）蛋白的晶體結(jié)構(gòu)

黃志偉團(tuán)隊(duì)最先解析了LbCpf1系統(tǒng)的晶體結(jié)構(gòu)^[17]。LbCpf1蛋白結(jié)構(gòu)呈三角形結(jié)構(gòu)，中間是一個(gè)帶有正電荷的凹槽。在未與crRNA結(jié)合時(shí)LbCpf1蛋白處于松散的構(gòu)象，結(jié)合后crRNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)與LbCpf1蛋白緊密結(jié)合，LbCpf1-crRNA的復(fù)合體由N端螺旋結(jié)構(gòu)域、C端RuvC結(jié)構(gòu)域及中央的寡核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（oligonucleo tide-?binding domain，OBD）3部分組成;OBD中的一個(gè)凸起的環(huán)狀螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)LbCpf1蛋白與底物的結(jié)合起決定性作用;crRNA的3?末端與靶DNA的配對(duì)同樣位于三角結(jié)構(gòu)的凹槽內(nèi)，僅crRNA的重復(fù)序列部分就可以引起LbCpf1蛋白構(gòu)象的巨大改變，不需要tracrRNA的參與（圖2）^[17]。

3.3?Cas13a（C2c2）蛋白的晶體結(jié)構(gòu)

Cas13a（C2c2）蛋白屬于第二類VI型CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸內(nèi)切酶，對(duì)LshC2c2晶體結(jié)構(gòu)的解析顯示，該蛋白同樣包括REC-lobe和NUC-lobe 2個(gè)葉片狀（lobe）結(jié)構(gòu)分別負(fù)責(zé)靶DNA的識(shí)別以及靶序列的剪切工作;REC-lobe由N端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）和Helical-1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，NUC-lobe由Helical-2結(jié)構(gòu)域及2個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域構(gòu)成;與SpCas9和LbCpf1蛋白不同的是REC-lobe中的NTD結(jié)構(gòu)域高度保守，NTD結(jié)構(gòu)域與Helical-1結(jié)構(gòu)域間包含有催化pre-crRNA成熟的位點(diǎn);crRNA與LshC2c2蛋白結(jié)合會(huì)使LshC2c2蛋白構(gòu)象發(fā)生巨大改變（圖3）^[18-19]。

4 ?基因編輯效率存在問題及研究進(jìn)展

盡管以CRISPR/Cas為工具的基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速，與其相關(guān)的技術(shù)還有很多問題亟待解決，如脫靶效應(yīng)、基因編輯效率不夠高等問題。針對(duì)這些問題，人們一直在尋找新的解決方法，例如開發(fā)更精確的脫靶效應(yīng)檢測(cè)方法、修飾Cas蛋白或sgRNA從而提高復(fù)合物的穩(wěn)定性，以及嘗試新的遞送方法等。

4.1脫靶與基因編輯

在CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行定點(diǎn)基因編輯過程中，間隔區(qū)序列與目標(biāo)基因序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，對(duì)目標(biāo)DNA序列的匹配具有一定程度的容忍度，允許個(gè)別堿基的錯(cuò)配，這一特點(diǎn)導(dǎo)致基因組中與目標(biāo)DNA序列有較少堿基差別的非目

標(biāo)DNA也會(huì)被誤切，基因編輯中這種現(xiàn)象稱為脫靶現(xiàn)象，脫靶現(xiàn)象的存在很大程度上阻礙了CRISPR/Cas系統(tǒng)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用^[20]。

CRISPR/Cas9脫靶現(xiàn)象首先在人類細(xì)胞中被驗(yàn)證^[21]。Keith團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人類細(xì)胞中的脫靶切割頻率較高，甚至存在5個(gè)堿基差別的非目標(biāo)基因仍可被切割，并因此導(dǎo)致突變^[21]。在整個(gè)目標(biāo)基因的識(shí)別過程中，sgRNA和PAM發(fā)揮非常重要的作用，脫靶的產(chǎn)生也很大程度上源自對(duì)目標(biāo)基因識(shí)別準(zhǔn)確性的降低;除sgRNA和PAM的影響之外^[22]，Cas9蛋白的構(gòu)象以及切割方式也影響基因編輯系統(tǒng)的精確度^[23]。表2列舉了目前在sgRNA的設(shè)計(jì)、PAM序列設(shè)計(jì)、CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)化（Cas9的構(gòu)象、Cas9-sgRNA的用量等）等3個(gè)方面在降低脫靶效應(yīng)方面的研究。

4.2?Cas蛋白切割效率

基因組編輯效率（efficiency of genome editing）指轉(zhuǎn)化事件中目的基因被成功編輯（發(fā)生插入、缺失或替換等）的百分?jǐn)?shù)^[47]?；蚓庉嬓实奶岣邔?duì)于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用具有重要作用。目前科研工作者主要通過CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的內(nèi)部序列優(yōu)化、基因編輯遞送系統(tǒng)的改善以及基因編輯修復(fù)策略的改變等方面的來研究提高編輯效率。

4.2.1??優(yōu)化CRISPR/Cas9基因編輯序列

（1）密碼子優(yōu)化。根據(jù)研究對(duì)象進(jìn)行密碼子優(yōu)化可以有效提高基因編輯效率。Xing等^[48]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的Cas9基因?qū)τ衩谆蚓庉嬓视兄匾绊?，?jīng)過玉米自身密碼子優(yōu)化后的Cas9比經(jīng)過人類密碼子優(yōu)化的Cas9獲得的基因編輯效率更高。

（2）啟動(dòng)子選擇。研究表明使用不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄對(duì)基因編輯效率有影響。Xing等^[48]構(gòu)建了分別含AtU6-26啟動(dòng)子、OsU3啟動(dòng)子和TaU3啟動(dòng)子的CRISPR/Cas9載體啟動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄，對(duì)目標(biāo)基因ZmHKT1的基因編輯效率分別是14.5%、26.3%和33.8%;因此在玉米基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建時(shí)TaU3啟動(dòng)子啟動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄是比較高效的選擇^[48]。不同啟動(dòng)子啟動(dòng)Cas9核酸內(nèi)切酶的表達(dá)也對(duì)編輯效率有影響;2015年，Svitashev等構(gòu)建了組成型啟動(dòng)子玉米泛素啟動(dòng)子（maize ubiquitin promoter，UBI啟動(dòng)子）、溫度調(diào)控型玉米甘露醇脫氫酶基因啟動(dòng)子（maize mannitol dehydrogenase gene promotor，MDH啟動(dòng)子）2種不同啟動(dòng)子控制經(jīng)過玉米密碼子優(yōu)化后的Cas9蛋白表達(dá)的CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)，研究不同載體系統(tǒng)對(duì)玉米無葉舌基因LIG1（Liguleless1）的基因編輯效率，結(jié)果表明，組成型UBI啟動(dòng)子的基因編輯效率比誘導(dǎo)型MDH啟動(dòng)子的基因編輯效率更高^[49]。而Feng等利用玉米減數(shù)分裂特異基因dmc1的啟動(dòng)子啟動(dòng)Cas9蛋白，其轉(zhuǎn)基因陽性愈傷中的突變效率高達(dá)100%，并且無脫靶效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas系統(tǒng)高效的基因組編輯^[50]。

（3）靶序列及sgRNA序列優(yōu)化。研究表明同一目標(biāo)基因內(nèi)不同位點(diǎn)的基因編輯效率也是不同的。研究人員對(duì)人EMX1基因設(shè)計(jì)不同位點(diǎn)進(jìn)行CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯脫靶效率的研究結(jié)果表明，PAM遠(yuǎn)端（5′端）序列的單堿基差異的脫靶率要高于PAM近端（3′端）的8～12個(gè)核心序列的單堿基差異;尤其是核心序列中若存在2～3個(gè)堿基的差異，脫靶效率大大降低，若存在5個(gè)堿基及以上的差異則幾乎無脫靶現(xiàn)象產(chǎn)生^[46]。研究還發(fā)現(xiàn)3′端靠近PAM位點(diǎn)第20位、16位、7位、1位均存在堿基偏好性^[51-52]。Farboud等發(fā)現(xiàn)sgRNA的3′端若為2個(gè)G切割效率最高^[53]。劉小樂團(tuán)隊(duì)分析發(fā)現(xiàn)sgRNA的3′端的3個(gè)序列為CGG時(shí)切割效率較高，而靠近PAM的3′端的4位序列若是T，則切割效率會(huì)降低^[52]。

4.2.2 ?改善遞送系統(tǒng)??CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)需要一定的遞送系統(tǒng)才能進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮編輯功能，如何高效地將編輯系統(tǒng)送入生物體內(nèi)直接影響到基因編輯的效率。目前遞送系統(tǒng)主要包括傳統(tǒng)的遞送系統(tǒng)如生物學(xué)介導(dǎo)的遞送（最常用的為細(xì)菌/病毒介導(dǎo)的傳遞系統(tǒng)）、非生物介質(zhì)遞送、粒子轟擊遞送、電脈沖及電磁輻射遞送等方法，以及近來使用的納米技術(shù)遞送系統(tǒng)^[54]。傳統(tǒng)的細(xì)菌/病毒介導(dǎo)的傳遞系統(tǒng)是植物遺傳轉(zhuǎn)化最常用的工具，但由于宿主范圍的限制，僅適用于部分植物物種或組織，同時(shí)還涉及將外源基因整合到宿主基因組中;粒子轟擊遞送方法可以通過基因槍或外力將生物分子遞送到多種植物種或組織的細(xì)胞中，但是此種遞送系統(tǒng)應(yīng)用局限性強(qiáng)，且經(jīng)常由于外力操作而導(dǎo)致組織損傷^[54]。

納米材料目前已經(jīng)廣泛用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，作為靶向給藥、癌癥治療和遺傳性疾病治療的遞送載體。在植物中，一些研究已經(jīng)使用納米材料將質(zhì)粒DNA、dsRNA、siRNA、蛋白質(zhì)和植物激素遞送到原生質(zhì)體或細(xì)胞中^[54]。目前很多研究已經(jīng)開發(fā)了基于不同材料的納米傳輸載體，主要包括MSN、CNT、LDH、DNA納米結(jié)構(gòu)和磁性納米顆粒^[55-63]。在對(duì)納米傳輸載體遞送外源材料進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)的研究方面取得了顯著性進(jìn)展，如功能化的CNT將質(zhì)粒DNA或siRNA形式的外源性功能基因傳遞到細(xì)胞中，從而導(dǎo)致外源基因的強(qiáng)烈表達(dá)或高效的基因沉默，并且CNT還可以在一段時(shí)間內(nèi)保護(hù)多核苷酸免于核酸酶降解^[58-59];另外CNT在無外部轟擊或化學(xué)助劑的情況下可以選擇性地將質(zhì)粒DNA遞送到葉綠體中^[57]。LDH納米片可以促進(jìn)dsRNA向模式植物煙草細(xì)胞中傳送^[61]。磁性納米顆?？稍谟写嬖诖艌?chǎng)的情況下通過花粉孔將外源DNA遞送進(jìn)花粉中^[62]。對(duì)于難以使用常規(guī)方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的植物來說，納米技術(shù)遞送系統(tǒng)無疑是有效的。這些開創(chuàng)性研究在開發(fā)基于納米材料的運(yùn)輸系統(tǒng)方面取得了重要進(jìn)展，為植物生物技術(shù)的未來應(yīng)用鋪平了道路。

與以往的轉(zhuǎn)基因遞送方法相比，基于納米材料的遞送系統(tǒng)為植物基因編輯提供了多種有利條件。首先，它同其他物化方法一樣克服了宿主范圍的限制，能適用于廣泛的植物物種和不同的組織，特別是那些難以進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得再生植株的植物可以通過原位遞送進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo);其次，在根據(jù)納米材料的特性進(jìn)行選擇和實(shí)現(xiàn)高效遞送的同時(shí)，還可將不同的生物分子同時(shí)運(yùn)送到目標(biāo)位置進(jìn)行遞送。該方法應(yīng)用到基因組編輯領(lǐng)域，可通過進(jìn)一步研究避免外源載體片段進(jìn)入植物細(xì)胞，增加公眾對(duì)于基因編輯的接受度^[54]。圖4展示了納米材料介導(dǎo)的植物基因工程的過程。

4.2.3 ?改善DSB修復(fù)策略??Cas9核酸內(nèi)切酶切割目標(biāo)DNA序列可引起DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB）。DSB可由2種內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制修復(fù)，非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重組介導(dǎo)的修復(fù)（homology-directed repair，HDR），從而實(shí)現(xiàn)基因的定向敲除、敲入等編輯過程^[64]。因NHEJ修復(fù)易于出錯(cuò)，目前大部分基因編輯研究傾向于利用HDR修復(fù)DSB的策略。由于NHEJ修復(fù)途徑

也屬于細(xì)胞內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，會(huì)與HDR修復(fù)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，因此若能抑制NHEJ的效率從而提高HD的修復(fù)效率，則會(huì)提高基因編輯的效率。目前已有一些方法經(jīng)研究證明對(duì)NHEJ修復(fù)過程有抑制作用，如使用Scr7這種DNA連接酶IV抑制劑抑制NHEJ活性^[65]，適當(dāng)改造基因編輯中的供體質(zhì)粒^[66]，設(shè)計(jì)非同源依賴的靶向整合（homology-in-?dependent targeted integration，HITI）方法^[67]等，這些方法均可有效提升基因編輯的效率。

5??提高基因編輯效率的其他幾個(gè)方面

隨著人們操控基因組技術(shù)的進(jìn)步，有3項(xiàng)基因組技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域的研究中起著舉足輕重的作用：高通量基因組測(cè)序技術(shù)、CRISPR基因編輯技術(shù)和單細(xì)胞基因組學(xué)（單細(xì)胞測(cè)序）。

基因組學(xué)是闡明整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及基因之間相互作用的科學(xué)。從全基因組的整體水平而不是單個(gè)基因水平，研究生命這個(gè)具有自身組織和自裝配特性的復(fù)雜系統(tǒng)，認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)的規(guī)律，更接近生物的本質(zhì)和全貌。高通量測(cè)序技術(shù)（high-throughput sequencing）又稱下一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing technology），以能一次并行對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長較短等為標(biāo)志。

對(duì)編輯效果，包括打靶效率（targeting efficiency）和脫靶效應(yīng)的檢測(cè)是評(píng)估基因組編輯實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。隨著高通量測(cè)序的普及，全基因組測(cè)序?qū)⒃絹碓狡毡椋ɑǜ俚臅r(shí)間和金錢），因此整合高通量測(cè)序與相關(guān)計(jì)算分析，利用CRISPR/?Cas介導(dǎo)的基因組編輯實(shí)現(xiàn)全基因組水平基因的功能篩選是基因編輯效果檢測(cè)評(píng)估的趨勢(shì)。

前人對(duì)于提高基因編輯效率做了大量的研究，尚未從根本上解決基因編輯過程中精準(zhǔn)有效切割的問題。要想解決這一問題需內(nèi)因與外因相結(jié)合進(jìn)行全面考量。從目前研究較多的CRISPR/?Cas系統(tǒng)序列特征（GC含量、堿基頻率特征、sgRNA與靶向DNA的錯(cuò)配特征、切割位點(diǎn)對(duì)堿基序列的偏好性等）延伸至物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)各方面的多種影響因素。

單細(xì)胞測(cè)序以單個(gè)細(xì)胞為單位，通過全基因組或轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，進(jìn)行高通量測(cè)序，能夠揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，在腫瘤學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，正成為生命科學(xué)研究的焦點(diǎn)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)^[68]，特別是單個(gè)細(xì)胞分離并逐個(gè)測(cè)序技術(shù)。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展下去一個(gè)很可能的結(jié)果，就是做到基因可控性。可控基因技術(shù)在單細(xì)胞測(cè)序基礎(chǔ)上進(jìn)行數(shù)據(jù)總結(jié)，對(duì)基因行為的結(jié)果達(dá)到可預(yù)測(cè)水平，從基因?qū)用嫒娅@知細(xì)胞乃至植物個(gè)體的生理變化，這一信息的反饋，成為基因編輯結(jié)果的實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)工具，將對(duì)提高基因編輯效率發(fā)生根本性的智能指導(dǎo)作用。

對(duì)于植物基因編輯而言，提高CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞的效率，影響轉(zhuǎn)導(dǎo)遞送的生物物理學(xué)層面上的障礙主要是細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和核膜的通透性，也會(huì)涉及染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)以及核小體的結(jié)構(gòu)等的問題^[69]。在植物胚性細(xì)胞一般細(xì)胞壁比較薄，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，轉(zhuǎn)導(dǎo)不僅因其發(fā)育潛能高而提高效率，而且因?yàn)榧?xì)胞壁的松散而容易侵染遞送和理化方式的遞送，從而提高最終的基因編輯效率。核膜對(duì)DNA、RNA和蛋白質(zhì)都有屏障作用^[70-71]。充分利用細(xì)胞周期中M期核膜解聚的窗口期（分裂前期至分裂后期，prophase-?telophase/M）進(jìn)行遞送是對(duì)核膜造成的障礙進(jìn)行針對(duì)性改善的有效措施。這種方法可以與同步化的誘導(dǎo)相結(jié)合，使更多的細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于M期狀態(tài)。一些脅迫因子也可以短時(shí)間改變細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的通透性，有助于細(xì)胞周期和遞送的調(diào)節(jié)^[72-73]。借助納米技術(shù)進(jìn)行CRISPR/Cas系統(tǒng)遞送方法的開發(fā)也是比較理想的一種方式，有待進(jìn)一步開發(fā)研究。目前在核小體不易展開的物理死角處如何進(jìn)行基因編輯尚無確切研究數(shù)據(jù)^[74]。

提高CRISPR/Cas系統(tǒng)的效率，在生化層面上，主要以CRISPR/Cas系統(tǒng)作用的原理以及晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，研究晶體結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)特征，通過對(duì)關(guān)鍵堿基進(jìn)行改變以及利用特定的化學(xué)修飾方法，改變蛋白的構(gòu)象，提高引導(dǎo)RNA以及Cas蛋白的活性及穩(wěn)定性，進(jìn)而增強(qiáng)引導(dǎo)RNA的引導(dǎo)特異性以及Cas蛋白對(duì)于目標(biāo)序列的切割效率。在生物學(xué)層面上，以細(xì)胞生長狀態(tài)和發(fā)育潛能為基礎(chǔ)，建立高效同步的繁殖體系^[75]，對(duì)基因編輯效率的提高具有明確的效益。在染色質(zhì)狀態(tài)特征等基礎(chǔ)上，研究DNA甲基化、組蛋白乙酰化、核小體占位、以及編輯位點(diǎn)是否處于超敏感位點(diǎn)等對(duì)編輯效率的影響^{[24， 76-77]}，使得CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)所處的細(xì)胞多數(shù)為可以行使功能的活細(xì)胞，同時(shí)Cas蛋白進(jìn)行切割時(shí)處于染色質(zhì)疏松狀態(tài)，DNA與組蛋白解聚，以及細(xì)胞分裂周期S期到G2期^[78]。

本文在對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的技術(shù)原理、晶體結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，著重分析CRISPR/?Cas系統(tǒng)序列特征，并討論了物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等多種因素的影響，認(rèn)為基因編輯效率的提高可以通過內(nèi)外因結(jié)合的方式，在基因編輯系統(tǒng)本身改造、基因編輯系統(tǒng)遞送時(shí)期和遞送方式選擇以及影響酶活和蛋白穩(wěn)定性等方面進(jìn)行優(yōu)化。

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