王靜宇 陳曉慧 申序 徐小萍 張梓浩 林玉玲 賴鐘雄

摘 ?要??為了解龍眼RNA甲基化相關(guān)基因的生物學(xué)功能，本研究基于基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)分析方法，進(jìn)行龍眼基因組RNA甲基化相關(guān)基因成員鑒定，蛋白結(jié)構(gòu)域及特性分析，分子進(jìn)化樹(shù)分析，體胚發(fā)生過(guò)程和組織器官基因表達(dá)水平分析以及ABA處理下的定量表達(dá)分析。結(jié)果顯示：龍眼中有7個(gè)參與RNA甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵基因，包括5個(gè)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因和2個(gè)去RNA甲基化酶基因;各成員內(nèi)含子數(shù)量差別較大，為4～28個(gè)不等;進(jìn)化樹(shù)分析顯示，龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶蛋白與甜橙親緣關(guān)系最近;蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，RNA甲基化相關(guān)酶具有保守的蛋白結(jié)構(gòu)域;龍眼RNA甲基化相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域中主要含有光響應(yīng)功能元件、激素響應(yīng)功能元件、脅迫響應(yīng)功能元件和分生組織表達(dá)響應(yīng)元件，推測(cè)RNA甲基化相關(guān)基因可能對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)不良環(huán)境有一定調(diào)節(jié)作用;RNA甲基化相關(guān)基因部分成員在龍眼體胚不同發(fā)生階段和不同組織器官中的表達(dá)有明顯區(qū)別，推測(cè)龍眼RNA甲基化相關(guān)基因可能參與不同體胚發(fā)育階段和組織器官形態(tài)建成;不同濃度ABA處理下，龍眼EC中RNA甲基化相關(guān)基因的表達(dá)情況各異，其中DlVIR、DlALKBH10B和DlMTB的相對(duì)表達(dá)量受到一定的抑制作用，而DlFIP37則呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，暗示龍眼RNA甲基化相關(guān)基因參與激素響應(yīng)途徑。本研究表明，龍眼RNA甲基化相關(guān)基因除了可能在葉的形成、花的發(fā)育和植株的形態(tài)建成等方面發(fā)揮重要的作用外，還可能參與調(diào)控胚胎發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫，推測(cè)龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員在功能上具有差異性和多樣性。

關(guān)鍵詞 ?龍眼;RNA甲基化相關(guān)基因;龍眼體胚發(fā)生早期;生物信息學(xué)分析;表達(dá)分析中圖分類號(hào)??S667.2??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Genome-wide Identification and Expression Analysis of RNA Methylation Related Genes During Somatic Embryogenesis in Dimocarpus longanLour.

WANG?Jingyu，?CHEN?Xiaohui，?SHEN?Xu，?XU?Xiaoping， ZHANG?Zihao， LIN?Yuling， LAI?Zhongxiong^*

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian?350002， China

Abstract ?To understand the biological function of the longan RNA methylation related genes， based on the genome and transcriptome data， the RNA methylation related genes in longan genome were identified， the protein domains and characteristics， the molecular evolution tree， and the tissues and organs somatic embryogenesis gene expression level and the analysis of the quantitative expression of ABA treatment were analyzed using the bioinformatics analysis method. The results showed that seven key genes were involved in the RNA methylation，?including five RNA methyltransferase genes and two RNA demethylase genes. The number of introns in each member varied greatly， ranging from 4 to 28. The result of evolutionary tree analysis showed that longon RNA methyltransferase and?demethylase proteins were most closely related toCitrus sinensis.Protein domain analysis showed that RNA methylation related enzymes had conserved protein domain. The promoter region of RNA methylation related genes mainly contained light response elements， hormone response elements， stress response elements and meristem expression response elements. It is speculated that RNA methylation related genes may have a certain regulatory effect on plant growth and development and maladaptive environment. Some members of RNA methylation related genes showed significant differences in the expression of longan somatic embryo at different stages of development and in different tissues and organs. It was speculated that longan RNA methylation related genes might be involved in different somatic embryo development stages and tissue and organ morphogenesis. The expressions of RNA methylation related genes in longan EC were different under ABA treatment at different concentrations. The relative expression ofDlVIR，?DlALKBH10BandDlMTBwas inhibited to some extent， whileDlFIP37showed up-regulated expression， suggesting that longan RNA methylation related genes were involved in the hormone response pathway. In this study， longan RNA methylation related genes may play an important role in leaf formation， flower development and plant morphogenesis， and may also be involved in regulating embryo development and responding to abiotic stress. It is speculated that longan RNA methylation related genes had differences and diversity in function.

Keywords ?longan; RNA methylation related genes; early stage of somatic embryogenesis; bioinformatic analysis; ?expression analysis

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.003

近年來(lái)，RNA修飾作為轉(zhuǎn)錄后水平的一類調(diào)控方式，由其參與調(diào)節(jié)的一系列RNA代謝過(guò)程對(duì)細(xì)胞的分裂和分化等過(guò)程有重要影響，受到了廣泛的關(guān)注，并在表觀遺傳領(lǐng)域被列為研究重點(diǎn)之一^[1]。RNA修飾存在多種類型，事實(shí)上，細(xì)胞中的每一類RNA分子都可以被轉(zhuǎn)錄后修飾，而且某些修飾在進(jìn)化上是保守的，可能是翻譯所不可缺少的，甲基化修飾則是RNA修飾的主要形式之一。在各種RNA甲基化修飾類型中，m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是mRNA中最豐富也是最常見(jiàn)的一種甲基化修飾^[2]，普遍存在于哺乳動(dòng)物、植物、細(xì)菌和病毒等多個(gè)物種中，在調(diào)控mRNA的代謝和加工過(guò)程中發(fā)揮著廣泛的作用^[3]。m6A雖早在19世紀(jì)70年代就被鑒定存在于RNA上，但其詳細(xì)的生物學(xué)功能仍是未知，隨著抗體富集和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組水平m6A分布圖譜得以精確繪制，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)m6A具有保守修飾基序RRACH（R代表A或G，H代表A、U或C），并分布于3'非翻譯區(qū)、外顯子和終止密碼子附近^[4]。m6A的甲基化是由3個(gè)關(guān)鍵亞基組成的多蛋白“writer”復(fù)合物完成的：“編碼器”RNA甲基轉(zhuǎn)移酶（如METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429）、“消碼器”RNA去甲基化酶（如ALKBH5）和“讀碼器”RNA甲基化修飾結(jié)合蛋白（如m6A結(jié)合蛋白YTHDC1）分別介導(dǎo)RNA甲基化的修飾過(guò)程、RNA去甲基化修飾過(guò)程和下游RNA的翻譯、降解等過(guò)程^[5-8]，所以m6A修飾是一種可逆的過(guò)程，它在由編碼器發(fā)揮作用的同時(shí)也可以被消碼器輕易地擦除^[9]，m6A還可以作為影響蛋白-RNA相互作用的RNA結(jié)構(gòu)開(kāi)關(guān)^[10]，參與并調(diào)節(jié)生物體的一些重要的生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，m6A能夠影響造血干細(xì)胞、精細(xì)胞、癌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的發(fā)育，進(jìn)而影響它們的穩(wěn)態(tài)和功能^[11]。

目前關(guān)于植物中m6A甲基化知識(shí)有限，但通過(guò)對(duì)擬南芥2個(gè)不同品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，m6A在植物中對(duì)mRNA具有高度保守性和動(dòng)態(tài)修飾性^[12]，這種保守性也促進(jìn)了我們對(duì)m6A修飾途徑的研究和理解。擬南芥中已經(jīng)鑒定了幾種參與m6A修飾的RNA甲基轉(zhuǎn)移化酶：分別是MTA70（METTL3的植物同源基因）、MTB（METTL14的植物同源基因）、FIP37（WTAP的同源基因）、VIR（KIAA1429的同源基因）和E3泛素連接蛋白HAKAI以及由ALKBH5編碼的RNA去甲基化酶ALKBH10B和ALKBH9B^[13]。它們具有調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的晝夜節(jié)律，影響干細(xì)胞功能的多樣性和調(diào)節(jié)植物開(kāi)花等功能^[14]，揭示了m6A修飾功能上的重要性。目前雖然關(guān)于植物中m6A甲基化的研究只在擬南芥和一些哺乳動(dòng)物的RNA甲基化研究中有所涉及，而關(guān)于其他高等植物m6A修飾作用的機(jī)制鮮有報(bào)道，尤其在無(wú)患子科龍眼中尚未涉及此方面的研究。

龍眼是我國(guó)著名的無(wú)患子科亞熱帶木本植物，其體胚發(fā)生情況與其生長(zhǎng)狀況、營(yíng)養(yǎng)水平、產(chǎn)量情況密切相聯(lián)^[15]，而體胚的生長(zhǎng)發(fā)育不僅受外界環(huán)境影響，還與植物本身遺傳特性、基因的表達(dá)和調(diào)控有關(guān)。脫落酸（ABA）是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要激素之一，它在高等植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的環(huán)境脅迫反應(yīng)中起著重要作用，特別是對(duì)植物體胚發(fā)生有多方面的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，ABA能夠促進(jìn)云南大葉茶和雜交落葉松等多種植物體胚成熟^[16]，且ABA對(duì)體胚的調(diào)控作用與其濃度和體胚發(fā)生階段均有關(guān)聯(lián)，其介導(dǎo)的反應(yīng)之一是誘導(dǎo)基因的表達(dá)^[17]，于是采用熒光定量PCR分析不同濃度ABA處理下，龍眼胚性愈傷組織中（EC）RNA甲基化相關(guān)基因的表達(dá)情況，推測(cè)各基因成員在EC發(fā)育過(guò)程中所執(zhí)行的功能。此外，龍眼基因組數(shù)據(jù)的釋放，為龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中RNA甲基化相關(guān)基因全基因組鑒定提供了良好的數(shù)據(jù)平臺(tái)。因此，本研究通過(guò)對(duì)龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員進(jìn)行系統(tǒng)命名，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)特性、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、啟動(dòng)子中順式作用元件進(jìn)行分析，以及各基因成員在不同體胚發(fā)生階段和組織器官特異表達(dá)FPKM分析，了解龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員可能存在的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步了解龍眼體胚發(fā)生過(guò)程的分子機(jī)制提供依據(jù)，也為研究RNA甲基化相關(guān)基因?qū)χ参锷L(zhǎng)發(fā)育的影響提供理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1材料

由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI登錄號(hào)：BioProject PRJNA305337）、龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（SRA050205）;龍眼、擬南芥、水稻、甜橙RNA甲基化酶基因家族等相關(guān)序列信息。以福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所誘導(dǎo)并繼代培養(yǎng)的龍眼LC胚性愈傷組織（EC）為材料，非胚性愈傷組織（NEC）、胚性愈傷組織（EC）、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)（ICpEC）和球形胚（GE）則參照賴鐘雄^[18]建立的方法獲得。

挑選培養(yǎng)了20?d的生長(zhǎng)發(fā)育較好的龍眼愈傷組織作為材料，進(jìn)行不同濃度的脫落酸（ABA）處理：取5個(gè)200?mL錐形瓶，潔凈干燥后各加入50?mL的MS液體培養(yǎng)基，之后分別加入不同濃度（0、5?、50、500、5000?μmol/L）的ABA。接著將選取好的龍眼愈傷組織接種于培養(yǎng)基中，置于25?℃、110?r/min的搖床中，黑暗培養(yǎng)24?h。最后收集處理后的材料進(jìn)行熒光定量分析^[19]。

1.2方法

1.2.1 ?RNA甲基化相關(guān)基因的鑒定與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 ?以擬南芥TAIR-Home Page（https：//www. arabidopsis.org/）下載的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶氨基酸序列為種子序列，經(jīng)與龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)同源比對(duì)，篩選獲得7條具有完整Open Reading Frame（ORF）的龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶候選序列。根據(jù)基因組注釋，采用DNAMAN 6.0軟件對(duì)RNA甲基化相關(guān)酶的gDNA、CDS以及啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)合NCBI Blast同源比對(duì)分析，初步確定龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員。再采用Conserved Domains Database（CDD）分析候選序列的蛋白結(jié)構(gòu)域，采用phmmer search HMMER?v 3.0軟件對(duì)候選序列蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步分析;通過(guò)DNAMAN?6.0軟件一致性比對(duì)，根據(jù)擬南芥RNA甲基化相關(guān)基因成員在龍眼基因組中的查找注釋，參考擬南芥RNA甲基化相關(guān)基因命名方法，對(duì)龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員進(jìn)行鑒定和命名。

利用水稻基因組RAP-DB-Keyword Search（https：//rapdb.dna.affrc.go.jp/tools/search/run），甜橙基因組Orange Genome Annotation Project（http：//citrus.hzau.edu.cn/orange/）網(wǎng)站下載到相應(yīng)的RNA甲基化相關(guān)酶的氨基酸序列，采用MEGA 6.06軟件中的鄰接法（Neighbor-joining method），自展法系數(shù)（Bootstrap）設(shè)置1000次重復(fù)檢驗(yàn)。對(duì)龍眼、擬南芥、水稻、甜橙4個(gè)物種的28條RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶成員氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.2.2 ?龍眼RNA甲基化相關(guān)基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析??采用TBtools對(duì)龍眼7條基因成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子、外顯子特征分析;采用ExPASy對(duì)7條RNA甲基化相關(guān)酶氨基酸序列進(jìn)行蛋白的等電點(diǎn)（pI）、分子量（Mw）、氨基酸數(shù)目（aa）及親水性分析;采用 Net Phos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn);通過(guò)MEME（multiple expectation maximization for motif elicitation）圣地亞哥超級(jí)計(jì)算機(jī)中心（SDSC）開(kāi)發(fā)的一套用來(lái)尋找一組相關(guān)的DNA序列或者蛋白質(zhì)序列的基序（motif）的程序在線分析龍眼RNA甲基化相關(guān)基因的保守motif;采用TBtools^[20]對(duì)獲得的motif進(jìn)行繪制。為分析RNA甲基化相關(guān)基因成員的基因結(jié)構(gòu)特征，整理出這4個(gè)物種的domain信息和domain長(zhǎng)度，再用TBtools構(gòu)建蛋白結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步了解RNA甲基化相關(guān)基因的生物學(xué)功能。

1.2.3 ?龍眼RNA甲基化相關(guān)基因啟動(dòng)子分析??從龍眼全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gigadb.org/？ tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）中提取的每個(gè)龍眼RNA甲基化相關(guān)基因起始密碼子上游2000 bp基因組序列搜索植物啟動(dòng)子順式作用元件，采用在線數(shù)據(jù)PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)順式作用元件^[21]。

1.2.4??RNA甲基化相關(guān)基因成員在龍眼體胚不同發(fā)育階段和不同組織器官特異表達(dá)分析??為進(jìn)一步了解各成員在龍眼體細(xì)胞胚胎和不同組織器官中可能發(fā)揮的功能特點(diǎn)，結(jié)合龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)提取的RNA甲基化相關(guān)基因在龍眼體胚發(fā)生的NEC、EC、ICpEC、GE各階段和不同組織器官（種子、根、莖、葉、花、花蕾、果肉、幼果、果皮）中特異表達(dá)的FPKM值，分析RNA甲基化酶基因各成員的相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.5 ?龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員在不同激素處理下的特異性表達(dá)??利用從龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取RNA甲基化相關(guān)基因成員在不同激素（2，4-D、2，4-D-KT、KT和MS）中特異表達(dá)的FPKM值，再通過(guò)TBtools構(gòu)建聚類分析圖以了解龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因成員在不同激素中的差異性表達(dá)。

1.2.6 ?龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員qPCR引物設(shè)計(jì)和分析??利用DlHAKAI、DlMTA70、DlMTB、DlFIP37、DlVIR、DlALKBH10B和DlALKBH9B 7條龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員的CDS序列通過(guò)Primer?3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0）初步設(shè)計(jì)正向和反向引物，再通過(guò)Beacon Designer Free Edition（http：//www.premierbiosoft.com）進(jìn)行篩選，得到以下符合引物設(shè)計(jì)原則的引物（表1）。再以Fe-SOD、elF-4a和elF-4a為內(nèi)參基因^[22]，根據(jù)內(nèi)參基因的FPKM值計(jì)算出RNA甲基化相關(guān)基因成員的相對(duì)表達(dá)量，并用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2??結(jié)果與分析

2.1龍眼RNA甲基化相關(guān)基因的鑒定

參考擬南芥RNA甲基化相關(guān)酶氨基酸序列，利用TBtools對(duì)龍眼基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行同源比對(duì)，篩選得到了7個(gè)RNA甲基化途徑中關(guān)鍵的基因。對(duì)獲得的RNA甲基化相關(guān)基因經(jīng)NCBI Blast比對(duì)，參考擬南芥RNA甲基化相關(guān)基因成員命名方法，將其命名為DlMTA70、DlMTB、DlVIR、DlHAKAI、DlFIP37、DlALKBH9B和DlALKBH10B（表2）。

2.2龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶蛋白質(zhì)特性分析

通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)特性分析發(fā)現(xiàn)（表3），龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的氨基酸長(zhǎng)度在374～2309?aa之間，蛋白分子量在42722.46～?252444.78?u之間，等電點(diǎn)（pI）在5.20～8.25之間。采用NetPhos 3.1 Server對(duì)龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：DlALKBH10B蛋白含有67個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Ser：43 Thr：20 Tyr：4），DlALKBH9B蛋白含有61個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Ser：39 Thr：15 Tyr：7），DlFIP37蛋白含有31個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Ser：17 Thr：13 Tyr：1），DlHAKAI蛋白含有28個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Ser：23 Thr：4 Tyr：1），DlMTA70蛋白含有70個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Ser：39 Thr：25 Tyr：6），DlMTB蛋白含有174個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Ser：117 Thr：35 Tyr：22），DlVIR蛋白含有含有254個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Ser：191 Thr：48 Tyr：15），可見(jiàn)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶不同成員可能存在功能差異。

2.3植物RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為進(jìn)一步了解RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的生物學(xué)功能，采用MEGA?6.06軟件構(gòu)建擬南芥、龍眼、水稻和甜橙的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，28條序列分為3個(gè)大支，與擬南芥中的RNA甲基化相關(guān)酶蛋白分支結(jié)構(gòu)相同，F(xiàn)IP37、MTA70和MTB為1個(gè)分支，HAKAI、VIR為一個(gè)分支，ALKBH9B和ALKBH10B為一個(gè)分支，其中FIP37、MTB和MTA70這個(gè)大分支又被分為2個(gè)獨(dú)立的分支，MTA70、MTB為一分支，F(xiàn)IP37單獨(dú)為一分支。擬南芥中RNA甲基化相關(guān)酶蛋白的這種分類與甜橙相同。龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶HAKAI屬于擬南芥中的HAKAI、VIR分支，甜橙的HAKAI分支;龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶VIR屬于擬南芥中的VIR、HAKAI分支，甜橙中的VIR分支;龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶MTA70屬于擬南芥的MTA70、MTB分支，甜橙的MTB分支;龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶MTB屬于擬南芥的MTA70、MTB分支，甜橙的MTA70分支;龍眼RNA去甲基化酶ALKBH10B屬于擬南芥ALKBH10B、ALKBH9B分支，甜橙的ALKBH10B分支;龍眼RNA去甲基化酶ALKBH9B屬于甜橙的ALKBH9B分支;龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶FIP37屬于擬南芥的FIP37分支。其中龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶蛋白與甜橙的親緣關(guān)系最近。

2.4龍眼RNA甲基化相關(guān)基因結(jié)構(gòu)分析

為分析RNA甲基化相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)一步了解龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的生物學(xué)功能，對(duì)龍眼7條基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行內(nèi)含子、外顯子數(shù)目及位置進(jìn)行分析（圖2）。結(jié)果顯示，所有龍眼RNA甲基化相關(guān)基因中第1個(gè)內(nèi)含子均位于成熟編碼序列內(nèi)部，可將信號(hào)序列和編碼序列明顯地區(qū)別開(kāi)來(lái)。最值得注意的是DlALKBH10B成員含有外顯子的非蛋白質(zhì)編碼部分。這7個(gè)RNA甲基化相關(guān)基因成員內(nèi)含子數(shù)為4～28個(gè)，其中最多的是龍眼DlVIR基因，有28個(gè)內(nèi)含子，其次是DlALKBH9B基因，有14個(gè)內(nèi)含子。RNA甲基化相關(guān)基因成員外顯子數(shù)目為3～30個(gè)。有3個(gè)成員的內(nèi)含子和外顯子的數(shù)目相同，同一分枝的RNA甲基化相關(guān)基因內(nèi)含子、外顯子位置分布和數(shù)量有相似的地方，但相似程度較小。另外這7個(gè)基因長(zhǎng)度也有顯著差異，長(zhǎng)度在500～30000?bp，其中最短的是DlHAKAI，最長(zhǎng)的是DlVIR，為30?000?bp左右，不同分支的RNA甲基化相關(guān)基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)數(shù)量分布差異明顯，這可能與其基因功能的分化有關(guān)。

2.5龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶蛋白

結(jié)構(gòu)域分析

為了解龍眼RNA甲基化相關(guān)基因在龍眼中的蛋白保守結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)與分布情況，通過(guò)MEME軟件，搜索出10個(gè)motif（圖3）。分析結(jié)果顯示，這7條序列中大多數(shù)包含motif?8和motif?10這2個(gè)motif，表明這2個(gè)基序在龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶中較為保守，其中最保守的是motif?10，其中有5個(gè)成員都包含該基序。從龍眼RNA甲基化相關(guān)酶的保守基序分散程度可知，大多數(shù)成員的基序比較聚集，除了DlALKBH10B的首個(gè)motif離其他2個(gè)motif較遠(yuǎn)，DlVIR的3個(gè)motif位置很分散，DlALKBH10B、DlFIP37和DlVIR這3個(gè)成員的motif數(shù)量較少，且位置較其他成員分散。

保守結(jié)構(gòu)域結(jié)果分析（圖4）顯示，龍眼RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶成員所含有的蛋白結(jié)構(gòu)域種類和數(shù)量各異，其中最值得注意的是DlALKBH9B含有最多的結(jié)構(gòu)功能域，包括2個(gè)ZnF_RBZ、1個(gè)zf-RanBP和1個(gè)DlALKBH10B同樣具有的2OG-FeII_Oxy結(jié)構(gòu)域，由此可見(jiàn)，在進(jìn)化樹(shù)中位于同一分支的部分成員具有相同的蛋白結(jié)構(gòu)域，推測(cè)它們可能具有相似的生物學(xué)功能。結(jié)合擬南芥、水稻和甜橙的氨基酸序列預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)成員都含有MT-A70結(jié)構(gòu)域，擬南芥AtVIR只含有唯一1個(gè)VIR_N結(jié)構(gòu)域，甜橙中的CsVIR成員只含有唯一1個(gè)Activator_LAG-3結(jié)構(gòu)域。且經(jīng)過(guò)分析得出龍眼、水稻和甜橙3個(gè)物種的HAKAI的首個(gè)結(jié)構(gòu)域均為RING-HC_HAKAI_like，推測(cè)該類型蛋白成員具有保守的結(jié)構(gòu)域。

2.6龍眼RNA甲基化相關(guān)基因的啟動(dòng)子分析

為深入了解龍眼RNA甲基化相關(guān)基因不同成員啟動(dòng)子的功能差異，對(duì)RNA甲基化相關(guān)基因上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)（圖5）。結(jié)果顯示，龍眼RNA甲基化相關(guān)基因（DlMTA70成員無(wú)完整的啟動(dòng)子，不予分析）的啟動(dòng)子區(qū)域中含有大量核心啟動(dòng)子元件如TATA-box和CAAT-box外，富含多個(gè)不同類型的光響應(yīng)元件，除此之外還含有植物激素應(yīng)答元件和逆境響應(yīng)元件。所有基因成員啟動(dòng)子區(qū)域含有的植物激素響應(yīng)元件包括生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（TGA-element）、水楊酸響應(yīng)元件（TCA element）、茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif）、赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif）和脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）。除了DlALKBH9B外，其他所有成員啟動(dòng)子區(qū)域都含有2種植物激素響應(yīng)元件。每個(gè)成員都預(yù)測(cè)到參與逆境響應(yīng)的功能與元件，包括厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件（ARE）、誘導(dǎo)子激活元件（AT-rich element）、防御和逆境響應(yīng)元件（TC-rich repeats）、低溫響應(yīng)元件（LTR）和干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS），但這些元件數(shù)量較少，例如DlFIP37成員啟動(dòng)子區(qū)域只含有1個(gè)防御和逆境響應(yīng)元件，因此我們只能判斷RNA甲基化相關(guān)基因參與逆境響應(yīng)，但不能確定它們對(duì)植物生長(zhǎng)過(guò)程中適應(yīng)逆境是必要的。此外，DlALKBH9B和DlHAKAI成員各含有1個(gè)玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件（O2-site），表明它們參與玉米醇溶蛋白的代謝過(guò)程，發(fā)揮決定玉米蛋白營(yíng)養(yǎng)特性的作用^[23]。DlHAKAI、DlMTA70和DlFIP37含有分生組織表達(dá)響應(yīng)元件，推測(cè)這3個(gè)成員參與調(diào)控龍眼的分生組織的分化過(guò)程。其中DlALKBH9B含有唯一1個(gè)胚乳表達(dá)負(fù)調(diào)控元件（AACA_motif），表明該成員參與龍眼的胚乳發(fā)育調(diào)控，影響種子的成熟。除了以上所述功能元件外，這6個(gè)成員的啟動(dòng)子區(qū)域還含有一些未命名的、功能未知的順式作用元件。通過(guò)對(duì)龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員的啟動(dòng)子分析，可以了解到RNA甲基化相關(guān)基因參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗逆境脅迫過(guò)程。

2.7龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中RNA甲基化相關(guān)基因表達(dá)分析

對(duì)RNA甲基化相關(guān)基因在龍眼早期胚胎的FPKM進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，RNA甲基化途徑中關(guān)鍵的基因在NEC階段表達(dá)量均較低，在體胚發(fā)生早期有較高的表達(dá)豐度（圖6）。其中VIR、MTB和FIP37在體胚發(fā)生早期階段中表達(dá)了逐漸上調(diào)。ALKBH9B在EC階段表達(dá)量最高;MTA、HAKAI和ALKBH10B則在ICpEC階段有最高的表達(dá)量。此外，RNA甲基化修飾基因HAKAI和RNA去甲基化基因ALKBH10B較其他基因在體胚發(fā)生早期中的表達(dá)量最高，提示體胚發(fā)生早期可能存在m6A形式的RNA甲基化和去甲基化事件。

2.8龍眼不同組織部位中RNA甲基化相關(guān)基因表達(dá)分析

對(duì)RNA甲基化相關(guān)基因在根、莖、葉、花、花芽、種子、果肉和果皮等不同組織部位中的表達(dá)分析顯示，龍眼RNA甲基修飾關(guān)鍵基因在不同組織部位中廣泛表達(dá)（圖7）。VIR、HAKAI和ALKBH9B在果肉中表達(dá)最高;MTA、MTB和FIP37在葉片中表達(dá)量最高;ALKBH10B在花中表達(dá)量最高，提示龍眼RNA甲基修飾關(guān)鍵基因?qū)堁鄄煌M織部位的生命活動(dòng)具有重要作用。這些成員在種子、果皮和根中均下調(diào)，除了HAKAI和FIP37在果皮和根微上調(diào)外，只有2個(gè)成員（VIR、HAKAI）在幼果中下調(diào)，其余成員均上調(diào)，但它們和ALKBH9B在果肉中都顯著上調(diào)，總之這些基因成員在種子、果皮、根、莖、花和花蕾中大部分均下調(diào)表達(dá)。由此可見(jiàn)，RNA甲基化相關(guān)修飾基因成員在龍眼早期胚胎發(fā)育的各個(gè)階段中表達(dá)程度不同，主要在非胚性階段表達(dá)水平較高，在胚性階段表達(dá)水平較低，推測(cè)各成員對(duì)龍眼的各個(gè)組織和器官及體胚階段的發(fā)育有差異性，具有重要的調(diào)節(jié)作用。

2.9龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員在不同激素下的表達(dá)模式分析

對(duì)龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員在不用激素下的表達(dá)模式分析顯示，只有DlHAKAI和DlALKBH10B2個(gè)成員在4種激素的處理下呈上調(diào)表達(dá)，其他成員均呈下調(diào)表達(dá)（圖8）。推測(cè)這4種激素可能促進(jìn)DlHAKAI和DlALKBH10B的表達(dá)，但對(duì)其他成員的表達(dá)起抑制作用。

采用qPCR方法研究不同濃度ABA處理下龍眼EC中RNA甲基化相關(guān)基因的特異性表達(dá)，分析結(jié)果（圖9）顯示，隨著ABA濃度升高，DlHAKAI的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，在低濃度（5和50?μmol/L）處理下呈下調(diào)表達(dá)，在高濃度500?μmol/L處理下呈上調(diào)表達(dá);與對(duì)照相比，不同濃度ABA處理對(duì)DlMTA70的表達(dá)無(wú)顯著差異，推測(cè)ABA可能對(duì)DlMTA70的表達(dá)無(wú)明顯影響;此外，不同濃度ABA處理的DlFIP37表達(dá)量均明顯高于對(duì)照，特別是在ABA濃度為5?μmol/L處理下DlFIP37的表達(dá)量最高，推測(cè)ABA可促進(jìn)DlFIP37的表達(dá);整體來(lái)看，隨著ABA濃度升高，DlALKBH9B的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，圖中顯示ABA濃度為500?μmol/L時(shí)達(dá)到最大，但并不能確定是DlALKBH9B在龍眼EC中最大表達(dá)的ABA濃度，我們可以在500～5000?μmol/L之間設(shè)置濃度梯度來(lái)研究其最適表達(dá)的ABA濃度。此外，在不同濃度ABA處理后的龍眼EC中，DlVIR和DlALKBH10B的表達(dá)模式幾乎一致，這2個(gè)成員的表達(dá)量均發(fā)生顯著變化，但都低于對(duì)照水平，可能與ABA影響龍眼體胚內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)有關(guān)。與對(duì)照相比，在5?μmol/L?ABA處理后的龍眼EC中DlMTB的表達(dá)量小幅度上調(diào)，但在其他濃度的ABA處理后DlMTB表達(dá)量均低于對(duì)照。以上結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，ABA能夠通過(guò)誘導(dǎo)基因的表達(dá)發(fā)揮作用^[24]，而不同濃度ABA處理對(duì)各基因的表達(dá)量影響也各不相同，同時(shí)驗(yàn)證了其生理作用不表現(xiàn)為兩重性^[25]。

3??討論

3.1龍眼RNA甲基化相關(guān)基因成員可能在功能上具有多樣性

已有研究大多是關(guān)于擬南芥和部分哺乳動(dòng)物RNA甲基化相關(guān)酶的基因組分析，而關(guān)于其他高等植物在此方面的研究則鮮有報(bào)道，且尚未見(jiàn)無(wú)患子科植物的RNA甲基化相關(guān)酶基因組分析報(bào)道。在龍眼基因組中篩選出7個(gè)RNA甲基化途徑中的關(guān)鍵酶，采用類似的方法，在甜橙和水稻基因組中分別鑒定出7個(gè)RNA甲基化過(guò)程中關(guān)鍵酶。通過(guò)對(duì)龍眼、甜橙、水稻和擬南芥4個(gè)物種的有關(guān)酶的氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，龍眼的RNA甲基化相關(guān)酶在進(jìn)化上與甜橙相似。再結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域分析，DlALKBH10B除含有2OG-FeII_Oxy結(jié)構(gòu)域外，還含有1個(gè)GGN結(jié)構(gòu)域;DlVIR除含有VIR_N結(jié)構(gòu)域外，還含有1個(gè)Creb_binding結(jié)構(gòu)域，與其他3個(gè)物種比較，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)辇堁跼NA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶所特有，體現(xiàn)了RNA甲基化相關(guān)酶的物種特異性。對(duì)龍眼RNA甲基化相關(guān)基因啟動(dòng)子序列順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，DlMTA70、DlHAKAI和DlFIP37中均含有分生組織表達(dá)相關(guān)順式作用調(diào)控元件，結(jié)合RNA甲基化相關(guān)基因在龍眼不同組織器官中的特異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，DlFIP37在花芽和花中表達(dá)量較低，而在龍眼隨后生長(zhǎng)階段的幼果中表達(dá)量較高，暗示DlFIP37介導(dǎo)龍眼關(guān)鍵芽分生組織基因轉(zhuǎn)錄本的m6A甲基化過(guò)程，并推測(cè)DlFIP37對(duì)芽干細(xì)胞的增殖分化有所影響，能夠防止分生組織的異常增殖^[26]。在擬南芥中關(guān)于m6A修飾研究顯示ALKBH10B是一種RNA去甲基化酶，能夠在體外和體內(nèi)逆轉(zhuǎn)m6A在mRNA中的修飾，其表達(dá)能夠降低poly（A）⁺RNA中的m6A的總水平，促進(jìn)植物開(kāi)花，并使植物呈現(xiàn)早花表型。總之m6A在擬南芥中能夠調(diào)控開(kāi)花時(shí)間，主要是ALKBH10B介導(dǎo)的m6A去甲基化酶通過(guò)影響關(guān)鍵開(kāi)花時(shí)間調(diào)控因子的mRNA的穩(wěn)定性，從而影響花的發(fā)育^[27]。圖7顯示ALKBH10B在龍眼的花中表達(dá)量較高，可推測(cè)其能夠促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)以使龍眼提前開(kāi)花。Batista等^[28]報(bào)道ALKBH9B可以在體外去除m6A，其去甲基化活性通過(guò)ALKBH9B與紫花苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白相互作用調(diào)控紫花苜?；ㄈ~病毒的感染。m6A已被發(fā)現(xiàn)在花的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮表觀遺傳學(xué)調(diào)控作用，但其是否影響開(kāi)花時(shí)間尚不清楚?？傊?，準(zhǔn)確的開(kāi)花時(shí)間對(duì)確保植物正常的繁殖至關(guān)重要，這些發(fā)現(xiàn)也有利于對(duì)RNA甲基化酶的作用機(jī)制開(kāi)展更深層次的研究。

3.2龍眼RNA甲基化相關(guān)基因可能參與調(diào)控體胚發(fā)育進(jìn)程

目前有關(guān)RNA甲基化相關(guān)基因?qū)χ参矬w胚發(fā)生過(guò)程的調(diào)控作用的報(bào)道仍較少，但已有報(bào)道稱MTA70基因的缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡或胚胎發(fā)育被抑制在球狀胚或心形胚階段，且FIP37在擬南芥中被首次確定與MTA70協(xié)同作用，由于胚乳和胚胎發(fā)育的延遲，FIP37的敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡^[29]。關(guān)于KIAA1429的敲除對(duì)小鼠胚胎發(fā)育影響的研究通過(guò)胚胎移植觀察不同時(shí)期的孕鼠胚胎，發(fā)現(xiàn)胚胎在移植幾天后發(fā)生阻滯和死亡，最終結(jié)果表明KIAA1429是一個(gè)參與胚胎發(fā)育的關(guān)鍵基因^[30]。研究發(fā)現(xiàn)ABA并不能促進(jìn)龍眼體胚的發(fā)生，Akula等^[31]認(rèn)為，單獨(dú)使用ABA會(huì)抑制體胚的發(fā)育。結(jié)合不同濃度ABA處理下龍眼EC中RNA甲基化相關(guān)基因的表達(dá)模式分析，DlMTA70和DlFIP37均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，而DlVIR的表達(dá)量則被抑制，故只能推測(cè)RNA甲基化相關(guān)基因在調(diào)控體胚發(fā)生過(guò)程中扮演了重要的角色，各成員影響體胚發(fā)育的機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步研究。

3.3?RNA甲基化相關(guān)基因可能響應(yīng)激素應(yīng)答和非生物脅迫反應(yīng)

隨著m6A研究的興起，RNA甲基化相關(guān)基因?qū)χ参锏募に貞?yīng)答和響應(yīng)逆境脅迫也逐漸引起人們的重視。通過(guò)對(duì)具有完整啟動(dòng)子的6個(gè)參與龍眼RNA甲基化關(guān)鍵酶基因成員的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，DlALKBH9B成員啟動(dòng)子區(qū)域只含有大量光響應(yīng)功能元件和厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件，幾乎沒(méi)有植物激素應(yīng)答元件。但結(jié)合這7個(gè)成員在龍眼早期胚胎和組織器官的FPKM分析發(fā)現(xiàn)，該成員參與調(diào)控植物體胚和各組織器官的發(fā)育。其他成員的啟動(dòng)子區(qū)域至少含有2個(gè)激素響應(yīng)功能元件，大多成員具有茉莉酸甲酯應(yīng)答元件，茉莉酸甲酯能夠促進(jìn)植物幼莖和葉片生長(zhǎng)并提高ABA含量，而ABA又能提高植物的抗旱性^[32]。此外，RNA甲基化相關(guān)基因成員啟動(dòng)子區(qū)域還具有脫落酸、生長(zhǎng)素和赤霉素等多種激素應(yīng)答元件，推測(cè)RNA甲基化相關(guān)基因成員參與多種植物激素應(yīng)答通路。各基因成員中上游啟動(dòng)子區(qū)含有干旱脅迫響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、防御和逆境響應(yīng)元件和低溫響應(yīng)元件等非生物脅迫響應(yīng)元件，推測(cè)在逆境中轉(zhuǎn)錄因子與RNA甲基化相關(guān)脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子的順式作用元件結(jié)合，特異性地啟動(dòng)應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而對(duì)非生物脅迫做出調(diào)節(jié)反應(yīng)^[33]。此外，龍眼EC在經(jīng)過(guò)不同濃度ABA處理后，RNA甲基化相關(guān)基因表達(dá)情況各異，這些結(jié)果都表明RNA甲基化酶參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫，但各類響應(yīng)元件數(shù)量較少，且分子作用機(jī)制例如龍眼RNA甲基化酶如何感受和傳遞外界不良環(huán)境的刺激以調(diào)控龍眼的生理機(jī)能還尚不明確，我們可以通過(guò)繼續(xù)研究其他物種如擬南芥和甜橙等含有與龍眼相同RNA甲基化酶基因的功能和作用機(jī)制作為參考?？傊?，未來(lái)的研究應(yīng)該探索m6A調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育更深層、更詳細(xì)的機(jī)制。

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