林榕燕 樊榮輝 陳裕德 羅遠(yuǎn)華 鐘淮欽 林 兵

(1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究中心/福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心,福建福州 350013；2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,福建福州 350003)

雞爪槭(Acer palmatum)是槭樹(shù)科槭樹(shù)屬落葉小喬木,其葉形美觀、葉色多變,具有很高的園林應(yīng)用價(jià)值,在世界范圍廣泛栽培[1]。葉色是雞爪槭觀賞價(jià)值的重要因素之一,研究雞爪槭葉片的呈色機(jī)理,可為提高其觀賞品質(zhì)和培育雞爪槭新品種奠定基礎(chǔ)。目前,有關(guān)雞爪槭葉片呈色機(jī)理的研究還處于起步階段,僅局限于色素種類、生理生化物質(zhì)和環(huán)境因素對(duì)其的影響[2-5],有關(guān)葉片呈色的分子調(diào)控機(jī)理的報(bào)道尚鮮見(jiàn)[6-7],雞爪槭分子育種的進(jìn)程相對(duì)滯后。

類胡蘿卜素是自然界中廣泛存在的一類天然色素,目前已超過(guò)700種天然類胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)[8],其是使花瓣、葉片、果實(shí)呈現(xiàn)黃色、橙色或紅色的有機(jī)色素[9]。同時(shí)類胡蘿卜素在光合組織中是必不可少的結(jié)構(gòu)成分,也是防止光氧化損傷的保護(hù)劑。在高等植物中,類胡蘿卜素是通過(guò)類異戊二烯途徑合成的,八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase,PSY)和八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶。PSY通過(guò)縮合兩個(gè)牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸得到八氫番茄紅素,是該途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶,其編碼的基因成為植物類胡蘿卜素基因工程研究中的重要基因[10]。目前在柿子(Diospyros kakiL.)[11]、桂花(Osmanthus fragrans)[12]、小麥(Triticum aestivumL.)[13]等植物中已分離獲得PSY基因。PDS是催化八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化為ζ-胡蘿卜素的關(guān)鍵酶[14],其編碼的PDS基因與PSY、ZDS、LCYb等基因協(xié)調(diào)作用,可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)花或果實(shí)中類胡蘿卜素的積累[15]。PDS基因已從觀賞向日葵(HelianthusannuusL.)[16]、矮牽牛 (Petunia hybrida)[17]、鶴望蘭(Strelitzia reginae)[18]等植物中分離獲得。但有關(guān)雞爪槭類胡蘿卜素合成途徑中的PSY和PDS基因的分離和鑒定研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中還未收錄雞爪槭PSY和PDS基因序列,本研究擬從雞爪槭中克隆PSY和PDS基因,初步分析其基因及編碼蛋白質(zhì)的序列特征,并檢測(cè)不同葉色品種及不同發(fā)育時(shí)期槭樹(shù)葉片中基因的表達(dá)情況,以期為進(jìn)一步研究八氫番茄紅素合成酶和八氫番茄紅素脫氫酶的功能調(diào)控奠定分子基礎(chǔ),為進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)提高雞爪槭的觀賞品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所花卉研究中心種質(zhì)資源圃保存的8個(gè)雞爪槭品種為供試材料,分別為黃金槭(葉片金黃色)、蝴蝶舞(綠色斑葉邊緣帶粉紅色)、青鴨(葉片嫩綠色)、橙之夢(mèng)(橙色葉片邊緣帶淡紅色)、桂(葉片黃綠色)、青枝垂(葉片綠色)、布加迪(葉片紫紅色)和出猩猩(葉片深紅色)。其中黃金槭葉片5個(gè)發(fā)育時(shí)期分別為芽葉期(葉片橙紅色)、展葉期(黃色葉片邊緣帶橙紅色)、呈色期(葉片金黃色)、小綠期(葉片黃綠色)及綠葉期(葉片綠色)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞爪槭葉片總RNA提取和cDNA合成 采用通用植物總RNA提取試劑盒(BioTeke,北京)進(jìn)行總RNA的提??；采用 PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa,日本)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成；5′RACE所需cDNA的逆轉(zhuǎn)錄是在cDNA第一鏈基礎(chǔ)上進(jìn)行純化和加尾,產(chǎn)物置于-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的甜橙(Citrus sinensis,NP_001275815.1)、柚子(Citrus maxima,AJT59421.1)、芒果(Mangifera indica,AFE85918.1)、木薯(Manihot esculenta,ACY42664.1)等植物的PSY基因序列,以及柚子(Citrus maxima,AJT59422.1)、甜橙(Citrus sinensis,AEQ29524.1)、甜櫻桃(Prunus avium,XP_021803084.1)、核桃(Juglans regia,XP_018828238.1)、番木瓜(Carica papaya,ABG72807.2)等植物的PDS基因序列,完成2個(gè)基因保守區(qū)引物PSY-F/PSY-R和PDS-F/PDS-R的設(shè)計(jì)。保守區(qū)測(cè)序成功后,設(shè)計(jì)3′RACE的兩條順式特異引物PSY-3′-1/PSY-3′-2 和PDS-3′-1/PDS-3′-2 及5′RACE 的兩條反向特異引物PSY-5′-1/PSY-5′-2和PDS-5′-1/PDS-5′-2。 拼接獲得PSY和PDS基因的cDNA全長(zhǎng),并設(shè)計(jì)用于 ORF擴(kuò)增的引物PSYORF-F/PSY-ORF-R和PDS-ORF-F/PDS-ORF-R。本研究所用的引物具體見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL,其中,100 ng·μL-1的模板 cDNA 1.0μL,10 μmol·L-1的上、下游引物各 1.0μL,10×ExTaq Buffer(含 Mg2+)2.5μL,2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 2.0μL,5 U·μL-1TakaRa Ex Taq 0.25μL,ddH2O 補(bǔ)充至25μL。 擴(kuò)增程序:94℃ 預(yù)變性 4 min；94℃ 變性 1 min,引物相應(yīng)的退火溫度退火45 s,72℃延伸1 min/1 kb,共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測(cè)后,回收目的片段,通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化,挑選陽(yáng)性克隆送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用在線 ExPASy、CBS Prediction Servers、Wolf Psort Prediction、SOPMA 等生物信息學(xué)分析軟件對(duì)PSY和PDS蛋白質(zhì)進(jìn)行基本理化性質(zhì)、卷曲結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位情況和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。通過(guò)DNAMAN進(jìn)行序列多重比對(duì)分析,并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4Psy.PDS的表達(dá)分析 采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(Takara,日本)和 7500 Real-Time PCR System儀(ABI,美國(guó)),以Actin為內(nèi)參基因,以雞爪槭品種黃金槭5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期葉片及8個(gè)不同葉色品種葉片cDNA為模板,利用引物PSY-RT-F/PSY-RT-R和PDS-RT-F/PSY-RT-R(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)PSY基因、PDS基因的相對(duì)表達(dá)量,每個(gè)反應(yīng)包括3個(gè)重復(fù)。采用2-△△Ct法[19]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞爪槭ApPSY基因和ApPDS基因的克隆

經(jīng)PCR擴(kuò)增,測(cè)序結(jié)果得到一條片段大小為818 bp的條帶(圖1),在線BLAST檢索分析序列,發(fā)現(xiàn)該cDNA序列與芒果、甜橙、柚子等植物的PSY基因cDNA序列同源性達(dá)86%～87%,初步確定得到的片段序列為雞爪槭PSY基因的保守序列。而后進(jìn)行5′和3′擴(kuò)增,測(cè)序后得到片段大小為662 bp和798 bp的特異性條帶。拼接這3個(gè)片段序列,得到一條長(zhǎng)度為1 497 bp的cDNA全長(zhǎng)序列,ORF框驗(yàn)證得到片段大小為1 299 bp的特異性條帶。測(cè)序結(jié)果通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線BLAST,結(jié)果表明,所得片段為PSY基因序列,命名為ApPSY。該cDNA長(zhǎng)1 497 bp,包含一個(gè)完整的共1 257 bp的ORF,共編碼418個(gè)氨基酸,GenBank登錄號(hào)為MF289486.1。

經(jīng)保守區(qū)的PCR擴(kuò)增,獲得一條1 305 bp的特異性條帶(圖1),在線BLAST比對(duì)后,該cDNA序列與番木瓜、甜橙、柚子等植物的PDS基因cDNA序列同源性達(dá)87%～89%,初步確定得到的片段序列為雞爪槭PDS基因的保守序列。而后進(jìn)行5′和3′擴(kuò)增,測(cè)序獲得片段大小為799 bp和1 003 bp的特異性條帶。將獲得的片段序列進(jìn)行拼接,得到一條長(zhǎng)度為1 974 bp的cDNA全長(zhǎng)序列,根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計(jì)相應(yīng)的ORF框驗(yàn)證引物,擴(kuò)增得到1 718 bp大小的特異性條帶,測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線BLAST,結(jié)果表明,所得片段為PDS基因序列,命名為ApPDS。該cDNA長(zhǎng)1 974 bp,包含一個(gè)完整的共1 692 bp的 ORF,共編碼563個(gè)氨基酸,GenBank登錄號(hào)為MF289485.1。

表1 雞爪槭PSY基因和PDS基因克隆及熒光定量PCR所用引物Table1 The primers used for gene clonina and fluorescent quantitation PCR of PSY and PDS of Acer palmatum

2.2 雞爪槭ApPSY和ApPDS蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

雞爪槭ApPSY蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示,該蛋白質(zhì)由418個(gè)氨基酸組成,分子式C2090H3321N589O614S20,分子量為47 165.14,理論等電點(diǎn)為8.94。該蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成,其中丙氨酸(Ala)所占比重最大,達(dá)到10.3%,組氨酸(His)最低,為0.5%。此外,雞爪槭ApPSY蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為55.11,是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白質(zhì),其總平均疏水指數(shù)(grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.262,推斷ApPSY蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)和卷曲螺旋預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,ApPSY蛋白質(zhì)不含有信號(hào)肽,不具有跨膜結(jié)構(gòu),不屬于跨膜蛋白質(zhì),不能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。對(duì)PSY蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)ApPSY定位于葉綠體(chlo)的可能性最大。利用SOPMA對(duì)雞爪槭ApPSY蛋白質(zhì)多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖2),ApPSY蛋白質(zhì)以α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲為主,延伸鏈為輔,所占比例分別為58.85%、27.75%和 9.81%,β-轉(zhuǎn)角所占比例最低,為3.59%。

圖1 雞爪槭ApPSY和ApPDS基因的克隆Fig.1 Cloning of ApPSY and ApPDS gene from Acer palmatum

利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)雞爪槭ApPDS蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,該蛋白質(zhì)由563個(gè)氨基酸組成,分子式C2842H4465N745O814S27,分子量為62 959.84,理論等電點(diǎn)為6.31,原子總數(shù)8 893。該蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成,其中亮氨酸(Leu)所占比重最大,達(dá)到11.0%,色氨酸(Trp)最低,為1.6%；不穩(wěn)定系數(shù)為39.14,是一個(gè)穩(wěn)定蛋白質(zhì)；GRAVY為-0.128,在第138個(gè)氨基酸表現(xiàn)為親水性最強(qiáng),為-2.667,推測(cè)ApPDS蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。此外,ApPDS蛋白質(zhì)不含有信號(hào)肽,不具有跨膜結(jié)構(gòu),不屬于跨膜蛋白質(zhì),不能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu),定位于葉綠體(chlo)的可能性最大。由圖2可知,ApPDS蛋白質(zhì)以α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲為主,所占比例分別為38.72%和32.50%；延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角為輔,所占比例分別為18.29%和10.48%。

圖2 雞爪槭ApPSY和ApPDS蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted secondary structure of the ApPSY and ApPDS protein from Acer palmatum

2.3 雞爪槭ApPSY和ApPDS編碼蛋白質(zhì)的序列比對(duì)與進(jìn)化分析

BLAST比對(duì)結(jié)果顯示,雞爪槭ApPSY基因編碼的氨基酸序列與其他植物的同源性均較高,其中,與甜橙(Citrus sinensis,NP_001275815.1)的同源性最高(80%),與柚子(Citrus maxima,AJT59421.1)和葡萄柚(Citrus x paradisi,AAD38051.2)的同源性為79%,與芒果(Mangifera indica,AFE85918.1)和茶樹(shù)(Camellia sinensis,AJB84620.1)的同源性均為78%,與羊躑躅(Rhododendron molle,APB08593.1)、木薯(Manihot esculenta,ACY42664.1)、西瓜(Citrulluslanatus,AGT57744.1)的同源性均為75%,與獼猴桃(Actinidia deliciosa,ACO53104.1)、剛果種(Coffea canephora,ABA43898.1)的同源性均為74%,與煙草(Nicotiana tabacum,AHA58684.1)、廣藿香(Pogostemon cablin,AHJ90431.1)、梔子花 (Gardeniajasminoides,AEF59491.1)和桂花 (Osmanthusfragrans,AFK66771.1)的同源性均為73%。利用DNANAN軟件對(duì)包括雞爪槭(Acer palmatum,MF289486.1)在內(nèi)的11種植物進(jìn)行序列多重比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)不同植物的PSY之間具有較高的一致性,其一致性達(dá)到81.90%(圖3)。

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載14種不同物種的PSY蛋白質(zhì)序列,結(jié)合雞爪槭ApPSY的編碼蛋白質(zhì)序列,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖4可知,序列被分為兩大分支,包括雞爪槭在內(nèi)的7種植物為一個(gè)分支,其他8種植物為另一分支。雞爪槭ApPSY與同為無(wú)患子目的柚子、葡萄柚和甜橙親緣關(guān)系較近,處于同一分支。

圖3 雞爪槭ApPSY氨基酸序列與其他植物多重比對(duì)Fig.3 Multiple alignment of the amino acid sequence of ApPSY among Acer palmatum and other plants

圖4 ApPSY系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of ApPSY

NCBI在線BLAST比對(duì)結(jié)果顯示,ApPDScDNA核酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物的同源性均較高,與茶樹(shù)(Camellia sinensis,AHB32104.1)的同源性最高(87%),與葡萄柚(Citrusxparadisi,AEQ29520.1)的同源性為86%,與柚子(Citrus maxima,AJT59422.1)、 甜橙 (Citrussinensis,AEQ29524.1)、羊躑躅 (Rhododendronmolle,APB08594.1)和長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus,AGH32499.1)的同源性均為85%,與甜櫻桃(Prunus avium,XP_021803084.1)、核桃(Juglans regia,XP_018828238.1)、番木瓜(Carica papaya,ABG72807.2)、碧桃(Prunus persica,XP_007222459.1)、蘋(píng)果(Malus domestica,ANS58097.1)和大豆(Glycine max,NP_001236769.2)的同源性均為83%,與柿樹(shù)(Diospyros kaki,ACY78343.1)和梅花(Prunusmume,XP_008222708.1)的同源性均為82%。利用DNANAN軟件對(duì)包括雞爪槭(Acer palmatum,MF289485.1)在內(nèi)的13種植物進(jìn)行序列多重比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)這些植物的PDS之間具有較高的一致性,其一致性達(dá)到87.10%(圖5)。

圖5 雞爪槭ApPDS氨基酸序列與其他植物多重比對(duì)Fig.5 Multiple alignment of the amino acid sequence of ApPDS among Acer palmatum and other plants

圖6 ApPDS系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of ApPDS

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載14個(gè)不同物種的PDS蛋白質(zhì)序列,結(jié)合雞爪槭ApPDS的編碼蛋白質(zhì)序列,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖6可知,序列被分為兩大分支,包括雞爪槭在內(nèi)的7種植物為一個(gè)分支,其他8種植物為另一分支。雞爪槭ApPDS與柚子、葡萄柚和甜橙的親緣關(guān)系較近。

2.4 不同雞爪槭葉色品種葉片ApPSY基因和ApPDS基因的表達(dá)情況

以雞爪槭8個(gè)不同葉色品種的葉片為材料,檢測(cè)ApPSY基因和ApPDS基因的表達(dá)水平 (圖7)。在8個(gè)不同葉色品種葉片中,ApPSY基因在黃金槭中的相對(duì)表達(dá)量最高,ApPDS基因則在橙之夢(mèng)中的相對(duì)表達(dá)量最高。

圖7 ApPSY和ApPDS基因在不同雞爪槭葉色品種中的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression of ApPSY and ApPDS gene in different leaf color varieties of Acer palmatum

2.5 不同發(fā)育時(shí)期葉片ApPSY基因和ApPDS基因的表達(dá)情況

對(duì)ApPSY基因和ApPDS基因在黃金槭5個(gè)發(fā)育時(shí)期葉片中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)(圖8),ApPSY基因和ApPDS基因在不同發(fā)育時(shí)期葉片中均有表達(dá),二者的相對(duì)表達(dá)量均隨著葉片發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),ApPSY基因在呈色期的相對(duì)表達(dá)量最高,ApPDS基因在小綠期的相對(duì)表達(dá)量最高。

圖8 ApPSY和ApPDS基因不同發(fā)育時(shí)期雞爪槭葉片的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of ApPSY and ApPDS gene in different growth periods of Acer palmatum leaves

3 討論

八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase,PSY)被普遍認(rèn)為是類胡蘿卜素合成途徑中最重要的一種調(diào)節(jié)酶。大部分的植物僅含有1個(gè)PSY基因,而番茄(Solanum lycopersicum)、木薯、煙草等部分植物中則有2個(gè)差異表達(dá)的PSY基因,玉米(Zea maysL.)、小麥和高粱[Sorghum bicolor(L.)Moench]等則有3個(gè)PSY基因[20]。在洋桔梗(Eustoma grandiflorum)中過(guò)表達(dá)枸杞(Lycium chinenseMiller)的LmPSY基因,提高了轉(zhuǎn)基因洋桔梗葉片中的總類胡蘿卜素含量[21]；用玉米中的PSY基因轉(zhuǎn)化水稻(Oryza sativa),不僅使水稻變成黃金稻,其胚乳中的類胡蘿卜素含量也大幅提升[22]；同樣地,番茄和木薯中的類胡蘿卜素含量增加也與PSY基因表達(dá)有著緊密的相關(guān)性[23-24]。本研究克隆獲得了雞爪槭ApPSY基因的cDNA序列,具有完整的開(kāi)放閱讀框,長(zhǎng)1 257 bp,共編碼418個(gè)氨基酸。同源性分析結(jié)果顯示,雞爪槭ApPSY蛋白質(zhì)序列與甜橙、蜜柑、芒果的PSY蛋白質(zhì)序列同源性較高,分別達(dá)80%、79%和78%,確定所獲得基因是雞爪槭ApPSY基因。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明,雞爪槭ApPSY蛋白質(zhì)與同為無(wú)患子目的柚子、葡萄柚和甜橙的PSY蛋白質(zhì)親緣關(guān)系較近,說(shuō)明其進(jìn)化基本符合植物分類學(xué)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明,隨著黃金槭葉色由紅色變黃色直至綠色的轉(zhuǎn)變過(guò)程,ApPSY基因在呈色期(葉片金黃色)表達(dá)量最高；在不同葉色品種葉片中,ApPSY基因在黃色品種中的相對(duì)表達(dá)量最高,隨后依次為橙色、綠色和紅色品種。梁敏華等[25]研究發(fā)現(xiàn),桃(Prunus persicaL.)果實(shí)PpPSY基因在黃肉品種發(fā)育組織中的表達(dá)水平高于白肉品種；對(duì)鶴望蘭[26]、龍膽(Gentiana lutea)[9]的研究也發(fā)現(xiàn),PSY的表達(dá)與黃色花的形成有關(guān)。由此推測(cè),雞爪槭葉片中ApPSY基因的表達(dá)與黃色著色的深淺具有相關(guān)性。

八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)同樣是類胡蘿卜素合成途徑中的重要限速酶之一,催化八氫番茄紅素向番茄紅素的轉(zhuǎn)變,是促進(jìn)類胡蘿卜素不飽和鍵形成的重要調(diào)節(jié)酶[27]。本研究克隆獲得了雞爪槭ApPDS基因的cDNA序列,具有完整的開(kāi)放閱讀框,長(zhǎng)1 692 bp,共編碼563個(gè)氨基酸。該序列推導(dǎo)的氨基酸與茶樹(shù)、葡萄柚、柚子PDS推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性較高,分別達(dá)87%、86%和85%,認(rèn)為所獲得基因是雞爪槭ApPDS基因。研究表明,蘋(píng)果MdPDS在著色期套袋果實(shí)果皮中的表達(dá)量隨果色增加而上升,在果實(shí)色澤發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28]；在甜瓜(Cucumis meloL.)[29]、草莓(Fragaria×ananassaDuch.)[30]果實(shí)發(fā)育過(guò)程中,PDS基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)與果實(shí)中類胡蘿卜素含量變化趨勢(shì)相符。此外,PDS基因在火鶴(Authurium andraeanum)[31]、鶴望蘭[18]花器官成色中可能具有調(diào)控作用,說(shuō)明PDS基因在植物的花和果實(shí)的成色過(guò)程中均起到重要作用。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,檢測(cè)了黃金槭葉色變化的5個(gè)不同時(shí)期及不同葉色品種葉片中ApPDS基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)ApPDS基因在不同發(fā)育時(shí)期葉片中的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低,在小綠期表達(dá)量最高；在不同葉色品種葉片中,ApPDS基因在橙色品種橙之夢(mèng)中的相對(duì)表達(dá)量最高,在其他葉色品種中均有表達(dá),但未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性,推測(cè)ApPDS基因需要與其他基因協(xié)調(diào)作用,從而在轉(zhuǎn)錄水平上影響雞爪槭葉片的呈色。

綜上,雞爪槭ApPSY和ApPDS基因序列的獲得為雞爪槭類胡蘿卜素的合成調(diào)控提供了基因信息。對(duì)基因的生物信息和表達(dá)情況分析,初步確定了基因所編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系及不同條件下基因的表達(dá)水平,為進(jìn)一步研究ApPSY和ApPDS的功能及其在雞爪槭葉片呈色中作用和調(diào)控機(jī)理奠定了分子基礎(chǔ),也為雞爪槭類胡蘿卜素前體代謝途徑研究提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究在雞爪槭葉片中克隆獲得了ApPSY基因和ApPDS基因,ApPSY基因cDNA序列長(zhǎng)1 497 bp,編碼418個(gè)氨基酸；ApPDS基因cDNA序列長(zhǎng)1 974 bp,編碼563個(gè)氨基酸。在不同葉色品種葉片中,ApPSY基因在黃金槭中的相對(duì)表達(dá)量最高,ApPDS基因則在橙之夢(mèng)中的相對(duì)表達(dá)量最高；在不同發(fā)育時(shí)期葉片中,ApPSY基因和ApPDS基因的相對(duì)表達(dá)量均隨著葉片發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),ApPSY基因在呈色期的相對(duì)表達(dá)量最高,ApPDS基因在小綠期的相對(duì)表達(dá)量最高。推測(cè)ApPSY基因可能參與到雞爪槭黃色葉的顯色反應(yīng),而ApPDS基因在雞爪槭葉片呈色中未發(fā)現(xiàn)明顯的調(diào)控作用,推測(cè)其可能需要與其他基因協(xié)調(diào)作用,從而在轉(zhuǎn)錄水平上影響雞爪槭葉片的呈色。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討ApPSY和ApPDS基因在雞爪槭中的生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。