諸葛菲 洪 彬 徐 胤 沈琦超 林新春

(浙江農林大學省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室/浙江省竹資源與高效利用協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 311300)

目前常見植物遺傳育種改良的方法有雜交育種、誘變育種、單倍體育種、多倍體育種、轉基因育種等。與其他育種方法相比,轉基因育種具有目的性強、育種時間短等優(yōu)點,但需要一個高效穩(wěn)定的再生體系,然而竹子高效穩(wěn)定的再生體系較難建立。目前關于竹子轉基因的報道并不常見,僅限于叢生竹種,如麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)[1]、版納甜龍竹(Dendrocalamushamiltonii)[2]和梁山慈竹(Dendrocalamus farinosus)等[3]。1982年,Metha等[4]首次報道了以印度箣竹(Bambusa arundinacea)成熟種胚為外植體誘導愈傷組織,并成功獲得胚狀體,通過體細胞胚胎發(fā)生途徑成功建立其再生體系。之后,研究者們利用不同外植體相繼建立多個竹種的再生體系,包括 1985年,Rao等[5]利用牡竹(Dendrocalamus strictus)的種子為外植體成功建立其再生體系；2009年,Yuan等[6]以孝順竹(Bambusa multiplex)的幼嫩花序為外植體獲得愈傷組織,并成功建立其再生體系；2010年,喬桂榮等[7]以麻竹花藥為外植體成功誘導出愈傷組織并獲得再生植株；2015年,Wei等[8]以佛肚竹(Bambusa ventricosa)的芽為外植體成功建立其再生體系。目前再生體系建立過程中所選的外植體多為種胚花藥等器官,但由于竹子開花較難,種子獲得較困難,因而以種胚、花藥等為外植體具有很大的局限性。有研究表明芽尖取材不受時間限制,取材方便,組織培養(yǎng)變異性小,可行性更高[9]。

馬來甜龍竹(Dendrocalamus asper)為牡竹屬(Dendrocalamus)大型叢生竹類,筍味甘甜鮮脆,營養(yǎng)豐富,是優(yōu)良的筍用竹種,其竿可作為造紙原料,也適宜庭園綠化栽培,具有較高的經濟價值和觀賞價值[10]。目前關于馬來甜龍竹組織培養(yǎng)的研究多以快繁為主,再生體系的建立僅有劉倩倩[11]以馬來甜龍竹成熟種胚為外植體,通過愈傷組織誘導成功建立其再生體系,但由于其成熟種子獲取較困難,試驗具有一定的局限性。本研究以馬來甜龍竹種胚培養(yǎng)增殖芽的芽尖為外植體,誘導出愈傷組織并進行植株再生,以期為進一步建立遺傳轉化體系的研究奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬來甜龍竹的種子采自云南省西雙版納傣族自治州勐臘縣的開花竹林。

2016年7月,將馬來甜龍竹種子剝去外殼置于燒杯中,浸泡24 h,0.5%次氯酸鈉溶液真空抽濾20 min,無菌水沖洗干凈后在SZ61體式顯微鏡(OLYMPUS,日本)下剝離種胚,將其接種至MS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)28天,待苗長至5 cm左右后移至含有芽增殖培養(yǎng)基[11]的廣口瓶中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)條件為光照強度為45 μmol·m-2·s-1,光周期16 h光照/8 h黑暗,溫度25±2℃,以0.5 cm左右無菌帶芽莖段為外植體進行后續(xù)試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物激素及有機添加物誘導芽尖愈傷組織1)分別以不同濃度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)(0、0.3、1、3、10 mg·L-1)誘導處理馬來甜龍竹芽尖愈傷組織；2)基本培養(yǎng)基為MS+3 mg·L-12,4-D,分別添加不同濃度6-芐基腺嘌呤 (6-benzyladenine,6-BA)(0、0.5、1、2 mg·L-1)誘導處理馬來甜龍竹芽尖愈傷組織；3)以添加有3 mg·L-12,4-D的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,分別添加不同濃度a-萘乙酸(naphthaleneacetic acid,NAA)(0、0.5、1、2 mg·L-1)誘導處理馬來甜龍竹芽尖愈傷組織；4)基本培養(yǎng)基為添加有3 mg·L-12,4-D、0.5 mg·L-1NAA的 MS培養(yǎng)基,分別添加500 mg·L-1脯氨酸(L-proline,Pro)、500 mg·L-1水解酪蛋白(casein hydrolysate,CH)、500 mg·L-1谷氨酰胺(L-glutamine,Gln)、500 mg·L-1CH+500 mg·L-1Gln+500 mg·L-1Pro、30 mg·L-1腺嘌呤(adenine henisulfate salt,Ads)、500 mg·L-1酵母提取物(yeast extract,YE)誘導處理馬來甜龍竹芽尖愈傷組織。

以上所有處理培養(yǎng)5周后觀察其生長狀況,并統(tǒng)計不同狀態(tài)愈傷組織誘導率(愈傷組織誘導率=誘導出愈傷組織的外植體數/無菌外植體數×100%；乳白色、致密顆粒狀愈傷組織誘導率=誘導出乳白色、致密顆粒狀愈傷組織的外植體數/無菌外植體數×100%),每個處理20管,每管1顆芽,每處理設3次重復。

1.2.2 不同激素組合及弱光預處理 以MS為基本培養(yǎng)基,分別設置以不同濃度激動素(kinetin,KT)(1、2、4 mg·L-1)、6-BA(0.5、1、2 mg·L-1)、NAA(0、0.25、0.5 mg·L-1)、弱光(10 μmol·m-2·s-1)處理不同時間(0、3、6 d)的四因素三水平正交試驗,選取大小較均一的致密顆粒狀乳白色愈傷組織團塊接種至分化培養(yǎng)基上,共9個處理。每隔20 d繼代一次,繼代時觀察愈傷組織生長狀況并統(tǒng)計愈傷組織分化率(愈傷組織分化率=已分化的愈傷組織數/接種的愈傷組織數×100%),每處理15塊愈傷,每處理設2次重復。

1.2.3 愈傷組織的組織細胞學觀察 選取不同發(fā)育時期的愈傷組織,參考Zhang等[12]的版納甜龍竹愈傷組織石蠟切片制作過程進行制片,在Olympus BX 60顯微鏡(OLYMPUS,日本)下觀察,并拍照分析。每處理設2次重復。

1.2.4 生根與馴化移栽 選取長勢基本一致的再生植株,移至含有 0、0.3、1、3、10 mg·L-1吲哚丁酸(indole-3-butyric acid,IBA)的生根培養(yǎng)基中進行生根誘導,每個處理各10管,每處理設2次重復。誘導生根4周后統(tǒng)計其生根率,并將其移至馴化室,強光(360 μmol·m-2·s-1)下煉苗一周后,將苗移栽至混合基質(蛭石∶珍珠巖∶泥炭=1∶1∶1)中。1個月后統(tǒng)計植株成活率。

1.3 數據分析

采用Excel 2010統(tǒng)計數據,利用SPSS 19.0進行數據分析,方差分析采用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 不同濃度2，4-D處理對芽尖愈傷組織誘導的影響

從馬來甜龍竹組培苗中選取長勢較好的植株,切取帶芽莖段(圖1-A)接種至含有不同濃度2,4-D的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),誘導1周左右后,馬來甜龍竹芽基部膨大,3周后愈傷組織初步形成,莖段逐漸褐化,5周后,愈傷組織最大直徑可達5 mm(圖1-B)。由圖1-C可知,當2,4-D的濃度為0～0.3 mg·L-1時,愈傷組織誘導率為0,芽只伸長生長或長出不定根；當2,4-D濃度為1 mg·L-1時,馬來甜龍竹芽尖可誘導出愈傷,愈傷組織和致密顆粒狀愈傷組織誘導率分別為35%和10%,且隨著2,4-D濃度的升高,愈傷組織和致密顆粒狀愈傷組織誘導率均呈先升高后下降的趨勢,當2,4-D濃度為3 mg·L-1時,愈傷組織誘導率達70%,致密顆粒狀愈傷組織誘導率為45%,且致密顆粒狀愈傷組織誘導率顯著高于其他處理；2,4-D濃度持續(xù)升高至10 mg·L-1時,愈傷組織和致密顆粒狀愈傷組織誘導率分別為55%和21.7%,均有所下降,且誘導出的愈傷組織有部分出現褐色斑點,說明過高濃度的2,4-D容易致使外植體和愈傷組織褐化。綜上,較適宜馬來甜龍竹芽尖愈傷組織誘導的2,4-D濃度為3 mg·L-1。

圖1 馬來甜龍竹愈傷組織誘導Fig.1 Callus induction of D.asper

2.2 不同濃度6-BA處理對芽尖愈傷組織誘導的影響

將帶芽莖段接種到含有3 mg·L-12,4-D和不同濃度6-BA的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),5周后統(tǒng)計愈傷組織及致密顆粒狀愈傷組織誘導率。由圖2可知,處理組隨著6-BA濃度的升高,愈傷組織及致密顆粒狀愈傷組織誘導率呈先升高后降低的趨勢,當6-BA濃度升高至1 mg·L-1時,愈傷組織及致密顆粒狀愈傷組織誘導率分別達57.5%和27.5%,與其他添加6-BA的處理均差異顯著,但愈傷組織誘導率顯著低于未添加6-BA處理,致密顆粒狀愈傷組織的誘導率未見明顯差異。同時,添加6-BA所誘導出的愈傷組織易褐化,不利于后續(xù)的增殖與分化。表明,6-BA不適于馬來甜龍竹芽尖愈傷組織的誘導。

2.3 不同濃度NAA處理對芽尖愈傷組織誘導的影響

將帶芽莖段接種到含有3 mg·L-12,4-D和不同濃度NAA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),5周后統(tǒng)計愈傷組織及致密顆粒狀愈傷組織誘導率。由圖3可知,在添加低濃度(≤1 mg·L-1)NAA時,愈傷組織誘導率與未添加NAA處理無顯著差異,但致密顆粒狀愈傷組織誘導率顯著高于未添加NAA處理；當NAA濃度升高至2 mg·L-1,愈傷組織及致密顆粒狀愈傷組織誘導率顯著降低。綜上,在愈傷組織誘導中可添加 0.5～1.0 mg·L-1NAA。

2.4 不同有機添加物處理對愈傷組織誘導的影響

圖2 6-BA濃度對馬來甜龍竹愈傷組織誘導的影響Fig.2 Effects of 6-BA concentration on callus induction of D.asper

圖3 NAA濃度對馬來甜龍竹愈傷組織誘導的影響Fig.3 Effects of NAA concentration on callus induction of D.asper

將帶芽莖段在含有 3 mg·L-12,4-D、0.5 mg·L-1NAA和不同有機添加物處理的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),5周后統(tǒng)計愈傷組織及致密顆粒狀愈傷組織誘導率。由圖4可知,單獨添加Pro、CH、Gln和Ads的4個處理與未添加有機物處理相比愈傷組織誘導率差異不顯著,但顯著高于添加YE和同時添加CH+Pro+Gln處理；所有添加有機物處理的致密顆粒狀愈傷組織誘導率均顯著低于未添加有機物處理。綜上,不添加有機添加物更利于馬來甜龍竹芽尖愈傷組織的誘導。

2.5 不同植物激素組合及弱光處理對愈傷組織分化的影響

圖4 不同有機添加物對馬來甜龍竹愈傷組織誘導的影響Fig.4 Effects of different organic addictives on callus induction of D.asper

選取生長狀態(tài)基本一致的致密顆粒狀淡黃色愈傷組織接種至分化培養(yǎng)基上,由表1可知,弱光處理6 d的愈傷組織表面最先出現綠點,一般在接種4～6 d陸續(xù)出現綠點(圖5-A),不進行弱光處理愈傷出現最晚,一般需要10 d,繼續(xù)培養(yǎng)綠點數增多,培養(yǎng)20 d后,綠點率基本穩(wěn)定,并陸續(xù)分化成苗。當弱光處理6 d,在MS 培養(yǎng)基中添加1 mg·L-16-BA、1 mg·L-1KT 和0.25 mg·L-1NAA時愈傷組織分化率最高達46.67%,與其他處理差異顯著,且有的愈傷同時分化出根和芽(圖5-B),再生苗的芽成簇,伸長生長良好。由正交試驗數據分析結果可知,馬來甜龍竹芽尖愈傷組織最適宜的分化條件是培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加1 mg·L-16-BA、1 mg·L-1KT 和 0.25 mg·L-1NAA,弱光處理 6 d。

2.6 愈傷組織的組織細胞學觀察

馬來甜龍竹經芽尖愈傷組織誘導和增殖后的主要呈現三種形態(tài):乳白色,致密顆粒狀(圖6-A),具有較強的增殖及分化能力,組織細胞學觀察表明,該種愈傷組織細胞多為近圓形,細胞核明顯,中間分生區(qū)細胞核較大,被中央液泡擠到細胞一側,染色較深,細胞排列整齊(圖6-B)；乳黃色,結構緊致、質地堅硬同時具有瘤狀和芽狀結構(圖6-C),繼續(xù)增殖或進行分化時易褐化,組織細胞學觀察表明,該種愈傷組織細胞圓形或矩形,細胞大小不一,有單一明顯的細胞核,細胞排列緊密,整體染色較深(圖6-D)；黃褐色或半透明、少量乳白色,表面凹凸不平、水化、易碎(圖6-E),且較難進行增殖和分化,組織細胞學觀察表明,該種愈傷組織邊緣細胞明顯但不規(guī)則,無細胞核,內部多數細胞無明顯細胞結構已被降解(圖6-F)。第一種狀態(tài)的愈傷組織具有較好的增殖和分化能力,因此在增殖、分化和探索遺傳轉化體系的過程中應盡量選擇這種愈傷組織。

表1 不同植物激素組合及弱光處理對愈傷組織分化的影響Table1 The effects of different plant growth regulators combinations and low light pretreatment on shoot differentiation of D.asper

觀察處于分化階段的綠點愈傷,結果表明馬來甜龍竹芽尖愈傷組織分化主要通過器官發(fā)生途徑形成芽原基和根原基(圖6-G、H)。

2.7 不同濃度IBA對再生苗生根誘導的影響

將長勢基本一致的再生苗移至生根培養(yǎng)基中進行誘導生根,由圖7可知,再生苗的生根率總體上隨著IBA濃度的增加而增加。在未添加IBA的1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周,再生苗可生根,生根率為40%,生根數量較少,一般為1～2條根,根細且長,部分根盤踞在試管底部；當IBA濃度為0.3～1 mg·L-1時,培養(yǎng)3 d后,再生苗開始陸續(xù)生根,4周后根數可達2～4條,細長,平均根長約4～5 cm,誘導率為45%；當IBA濃度升高至3 mg·L-1時,培養(yǎng)3 d后再生苗陸續(xù)被誘導生根,4周后根數可達3～5條,平均根長為4～5 cm(圖5-C),根較粗壯,部分長有側根,誘導率為55%；當IBA濃度升高至10 mg·L-1時,培養(yǎng)7 d左右再生苗開始生根,4周后平均誘導根數3～5條,誘導率為65%明顯高于其他處理,平均根長為1.75 cm,與其他處理相比該處理根較粗短,彎曲,植株發(fā)黃長勢較差。綜上,馬來甜龍竹再生苗誘導生根較適宜的IBA濃度為3 mg·L-1。

2.8 再生苗的馴化與移栽

將誘導生根4周后的馬來甜龍竹再生苗移至馴化室煉苗,1 d后移栽到基質中,30 d后統(tǒng)計其成活率為83.33%(圖5-D)。

3 討論

2,4-D是竹子愈傷組織誘導的關鍵因子,不添加2,4-D很難誘導出愈傷組織,但高濃度的2,4-D會降低愈傷組織分化再生能力,且不同竹種愈傷組織誘導所需要的2,4-D濃度存在差異[13]。如袁金玲等[14]在孝順竹(Bambusa multiplex)愈傷組織誘導中發(fā)現添加4 mg·L-12,4-D效果較好。Ye等[15]研究發(fā)現在添加8 mg·L-12,4-D和0.5 mg·L-1IBA的培養(yǎng)基中麻竹(D.latiflorus)芽尖愈傷組織誘導效果較好。本研究中,不添加2,4-D或低濃度(0.3 mg·L-1)時,無愈傷組織產生,當2,4-D濃度增加至3 mg·L-1時,馬來甜龍竹芽尖誘導的愈傷組織大多呈乳白色且為致密顆粒狀,易增殖和分化,是較適宜的誘導濃度,當濃度繼續(xù)升高至10 mg·L-1時,愈傷組織多為水質團狀、疏松、致密顆粒愈傷組織較少,且易褐化,不利于增殖與分化。

圖5 馬來甜龍竹芽尖再生體系的建立Fig.5 The establishment of plantlets regenerated system from shoot tips of D.asper

有研究表明在玉米、水稻等禾本科植物中,低濃度的KT或6-BA對愈傷組織的誘導具有促進作用,并且能促進愈傷組織狀態(tài)分化[16-18]。Bag等[19]研究發(fā)現較高濃度(5.0～7.5 μmol·L-1)的 2,4-D 與 5 μmol·L-16-BA組合有利于版納甜龍竹芽尖愈傷組織的誘導。但也有研究表明,在愈傷組織誘導和增殖時添加細胞分裂素不利于愈傷組織的生長,且易導致其褐化[20]。本研究中,添加不同濃度的6-BA導致馬來甜龍竹芽尖愈傷組織誘導過程中外植體和愈傷組織易褐化,不利于增殖,愈傷組織及致密顆粒狀愈傷組織誘導率整體均下降。

NAA多用于組培苗的生根,較少用于竹類植物愈傷組織誘導,目前僅有關于龍竹(Dendrocalamusgiganteus)[21]和草本竹(Mniochloa abersend)[22]NAA與2,4-D相結合誘導出致密顆粒狀愈傷組織的報道。本研究中0.5～1.0 mg·L-1NAA 與3 mg·L-12,4-D 相結合更有利于馬來甜龍竹芽尖致密顆粒狀愈傷組織的誘導。

在組織培養(yǎng)過程添加有機添加物有利于培養(yǎng)物的生長,其主要原因可能是天然物質中含有各種氨基酸、細胞分裂素、維生素等能促進生長的成分[23-25]。Zang等[26]在版納甜龍竹(D.hamiltonii)芽尖愈傷組織誘導時發(fā)現,添加 500 mg·L-1CH+500 mg·L-1Pro+500 mg·L-1Gln有利于愈傷組織的誘導。本研究發(fā)現添加天然有機添加物并不利于馬來甜龍竹芽尖愈傷組織誘導,反而導致致密顆粒狀愈傷組織的比例顯著下降,與前人研究不一致,說明不同竹種愈傷組織誘導過程中不同有機添加物對其影響存在差異。

圖6 愈傷組織組織細胞學觀察Fig.6 Histological analysis of callus

細胞分裂素主要是促進芽的分化和增殖,較低濃度的生長素可促進芽的伸長生長。有研究表明,只有當生長素和細胞分裂素的比率達到一定值時才能誘導器官分化。愈傷組織是否能成功分化成再生植株是再生體系建立的最關鍵因素,在分化培養(yǎng)過程中,細胞分裂素與生長素的比率起著關鍵性作用[12,27]。如Zang等[26]研究發(fā)現,在版納甜龍竹(D.hamiltonii)芽尖誘導的愈傷組織分化過程中不同激素對芽分化影響表現為NAA＞KT＞6-BA。本研究結果表明,在馬來甜龍竹芽尖愈傷組織分化過程中不同激素的影響表現為KT＞NAA＞6-BA,說明不同竹子品種在芽尖愈傷組織再生過程中不同激素對它們的影響存在差異。

圖7 IBA濃度對馬來甜龍竹再生苗生根的影響Fig.7 Effects of IBA concentration on callus induction of D.asper

申娟等[28]研究了不同光照強度對粳稻愈傷組織分化的影響,結果表明每日補充16 h光照強度為37.5～50 μmol·m-2·s-1的光照,愈傷組織表現出細胞分裂快,結構疏松,顏色淺而透明,分化能力較強,隨著光照強度的升高或降低,愈傷組織的質量都會降低。本研究結果表明弱光處理可促進再生比率,縮短分化時間。但馬來甜龍竹屬愈傷組織分化過程中較適宜的光照強度仍需進一步研究。

4 結論

本研究以馬來甜龍竹種胚培養(yǎng)芽尖為材料進行愈傷組織誘導和分化試驗,成功建立其芽尖再生體系,其技術體系為以馬來甜龍竹種胚培養(yǎng)的無菌帶芽莖段為外植體,將其接種到添加有3 mg·L-12,4-D和0.5 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上誘導愈傷組織,選取乳白色、致密顆粒狀愈傷組織接種至分化培養(yǎng)基(MS+1 mg·L-16-BA+1 mg·L-1KT+0.25 mg·L-1NAA)上,10 μmol·m-2·s-1弱光處理 6 d 后移至光強為 45 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室進行分化,獲得的再生苗接種到生根培養(yǎng)基(1/2 MS+3 mg·L-1IBA)上誘導生根后進行馴化移栽。馬來甜龍竹愈傷組織主要有3種類型,且不同種類愈傷組織在不同的時間與激素水平都有發(fā)生,并以混合的狀態(tài)存在,其中乳白色,致密顆粒狀愈傷組織具有較強的增殖與分化能力。本研究為馬來甜龍竹再生體系的建立和遺傳改良提供了參考和技術途徑。