萬 軍, 田 忠, 姚柏宇, 劉 翀, 何靜妮, 殷 鑫, 史 旸

萬軍, 田忠, 姚柏宇, 劉翀, 何靜妮, 殷鑫, 史旸, 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第十普通外科 遼寧省沈陽市 110000

核心提要：腸黏膜屏障是機(jī)體抵御外界病原侵襲和維持腸道穩(wěn)態(tài)的重要屏障結(jié)構(gòu).腸堿性磷酸酶參與調(diào)節(jié)十二指腸pH、反映腸道的發(fā)育情況及小腸上皮細(xì)胞的吸收能力, 降低腸道脂多糖毒力、減低腸道炎癥、調(diào)節(jié)腸道菌群分布、抑制細(xì)菌位移.

0 引言

腸黏膜屏障是機(jī)體抵御外界病原侵襲和維持腸道穩(wěn)態(tài)的重要屏障結(jié)構(gòu), 主要由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、 生物屏障和免疫屏障四個部分構(gòu)成[1].其中腸黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白構(gòu)成機(jī)械屏障； 腸黏膜上皮細(xì)胞分泌黏液, 胃腸道分泌消化液和腸道共生菌產(chǎn)生抑菌物質(zhì)共同構(gòu)成腸黏膜化學(xué)屏障； 腸道共生菌群及宿主腸道微環(huán)境相互作用, 互相影響構(gòu)成了腸黏膜生物屏障；腸道淋巴系統(tǒng)及其分泌的免疫活性物質(zhì)抑制腸道炎癥構(gòu)成腸黏膜免疫屏障[2,3].完整的腸黏膜屏障是維持腸黏膜屏障功能的重要條件, 四個部分缺一不可, 任何一部分損傷都會破壞腸黏膜屏障穩(wěn)定性, 威脅機(jī)體的生命健康.相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[4]腸堿性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase, IAP)在維持腸黏膜完整和改善功能上發(fā)揮著一定的作用.

1 IAP

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)是廣泛分布于人體組織器官的單磷脂水解酶, 它本身是一種膜結(jié)合金屬糖蛋白, 由兩個亞單位組成, 作為同源二聚體酶, 包括四種同工酶, 主要分為組織非特異性AKP和組織特異性AKP, 前者主要在肝、腎和骨組織中表達(dá), 后者包括IAP、胎盤堿性磷酸酶(placental alkaline phosphatase,PLAP)和生殖細(xì)胞堿性磷酸酶(germ cell alkaline phosphatase, GCAP)[5].IAP是一種能水解單磷酸酯的刷狀緣蛋白, 存在于腸細(xì)胞刷狀緣的頂端微絨毛中, 并分泌到腸腔和血液中, 是維持腸道穩(wěn)態(tài)所必需的腸黏膜防御因子[6-9].IAP參與調(diào)節(jié)腸道脂類物質(zhì)吸收, 在脂肪酸通過質(zhì)膜進(jìn)入腸上皮細(xì)胞過程中起到限速作用[10,11],Zhou等[12]研究發(fā)現(xiàn)IAP蛋白及mRNA的表達(dá)量與肥胖相關(guān).

Narisawa等[13]研究發(fā)現(xiàn)通過高脂肪飲食喂養(yǎng)小鼠,對比IAP基因敲除的實(shí)驗(yàn)鼠與野生型小鼠, IAP基因敲除小鼠在高脂肪飲食條件下體重增加更多.以往研究發(fā)現(xiàn)IAP主要在十二指腸表達(dá), 在堿性條件下發(fā)揮作用[13],該位置IAP的mRNA表達(dá)水平及酶的活性最高, 在空腸和回腸低表達(dá)[14], 但I(xiàn)AP在胃中幾乎不表達(dá)[15].腸道細(xì)菌在胃十二指腸缺乏但在空回腸菌量增多, 體現(xiàn)了IAP表達(dá)量與腸道細(xì)菌定植水平相反的特性[16].為進(jìn)一步研究IAP對腸道微生物影響提供了思路.

有研究證實(shí)[17], 通過比較喂養(yǎng)0-28 d的同窩不同生長天數(shù)的仔豬, 老齡仔豬相比新生仔豬腸道IAP表達(dá)量更多, 認(rèn)為仔豬小腸中的IAP活性與動物生存時間具有相關(guān)性.同時也有研究[18,19]觀察到嚙齒類動物哺乳期IAP表達(dá)水平最低, 隨著動物成長到斷奶年齡, IAP表達(dá)量增至成年正常水平.以上研究提示嚙齒動物IAP的表達(dá)及生物活性隨飲食及年齡變化而改變.同時也有相關(guān)研究[4]證明人體饑餓時可導(dǎo)致腸道IAP的表達(dá)及活性下降, 增加腸道炎癥的易感性.總之IAP在改善腸道功能上發(fā)揮了作用.

2 IAP與腸道屏障

2.1 IAP維護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障 腸道機(jī)械屏障作為腸黏膜屏障重要的一部分, 其腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白發(fā)揮著重要的作用, 而IAP在維持細(xì)胞間緊密連接發(fā)揮作用.相關(guān)研究證實(shí)基因敲除小鼠與野生型小鼠相比, IAP基因缺失導(dǎo)致了緊密連接蛋白ZO-1, ZO-2和Occludin水平顯著降低, 在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中通過刺激IAP過表達(dá)緊密連接蛋白ZO-1, ZO-2的mRNA水平增加了2倍, 證實(shí)了IAP通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白改善腸黏膜通透性進(jìn)而維持腸黏膜屏障功能[20].Rentea等[21]的研究也發(fā)現(xiàn), 給予低劑量外生型牛IAP, 可以更好的降低腸黏膜的通透性, 保護(hù)腸道屏障完整.Hamarneh等[22]首先通過研究IAP基因敲除小鼠和野生型小鼠, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠緊密連接蛋白表達(dá)量較野生型小鼠低, 證實(shí)腸道屏障受損與IAP表達(dá)缺失相關(guān).再研究給予持續(xù)缺乏腸內(nèi)營養(yǎng)48 h的饑餓模型小鼠腸道補(bǔ)充外源性IAP, 發(fā)現(xiàn)缺乏腸內(nèi)營養(yǎng)喂養(yǎng)IAP表達(dá)也會降低, 進(jìn)而造成屏障緊密連接蛋白缺乏, 補(bǔ)充外源性的IAP可逆轉(zhuǎn)腸道屏障功能障礙和改善腸內(nèi)喂養(yǎng)不足導(dǎo)致的緊密連接蛋白損害.從以上研究結(jié)果可以得出, IAP在維護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障, 改善腸道通透性中確實(shí)發(fā)揮了作用, 但目前研究對IAP、黏膜屏障及緊密連接蛋白間的具體分子機(jī)制尚不明確, 還需同時要進(jìn)一步研究.

2.2 IAP支持腸黏膜免疫屏障 腸道免疫屏障由獲得免疫和固有免疫兩部分構(gòu)成, 免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA)和抗菌肽及黏蛋白分別構(gòu)成獲得免疫和固有免疫的重要效應(yīng)分子和活性成分[23].Lassenius等[24]研究證實(shí)患有1型糖尿病的患者表現(xiàn)出腸道炎癥的跡象.與對照組相比, 糖尿病患者的糞便鈣防衛(wèi)蛋白水平較高, 糞便IAP活性較低, 伴較低的丙酸鹽和丁酸鹽濃度.此外,1型糖尿病患者的糞便IgA含量和與氧化LDL結(jié)合的抗體水平降低.在小鼠中, 口服IAP補(bǔ)充劑顯著增加腸IgA水平.人體腸道中存在大量的革蘭陰性細(xì)菌, 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁重要組成部分, 是引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)的重要因素.Bates等[25]和Bentala等[26]的研究發(fā)現(xiàn)IAP可通過激活腸上皮細(xì)胞Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)4基因表達(dá), 識別革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中的LPS并誘導(dǎo)宿主進(jìn)行免疫應(yīng)答和損傷修復(fù), 巨噬細(xì)胞募集(級聯(lián)誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞)激活誘導(dǎo)核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)和TLR3基因, 并通過 MyD88依賴途徑抑制炎癥性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-6和IL-12的表達(dá), 從而抵抗腸道感染.TLR4的大量激活可能進(jìn)一步抑制了TNF-α的表達(dá), 抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng), 從而降低LPS的毒性.Hwang等[27]研究發(fā)現(xiàn)也表明, IAP通過TLR4/NF-κB介導(dǎo)途徑維護(hù)腸黏膜屏障功能的正常.

圖1 刷狀緣IAP對腸道菌群和LPS誘導(dǎo)的炎癥的釋放的作用機(jī)制.炎癥狀態(tài)下, 促炎因子可抑制有保護(hù)性作用的IAP的含量和活性.IAP使細(xì)菌LPS脫磷, 從而使LPS解毒, 從而阻止下游免疫細(xì)胞的激活和炎癥反應(yīng).IAP對多種細(xì)菌的生長和存活有抑制作用, 并能抑制細(xì)菌位移.IAP：腸堿性磷酸酶； LPS：脂多糖.

2.3 IAP調(diào)節(jié)腸黏膜化學(xué)屏障 作為腸黏膜屏障中重要的一部分, 化學(xué)屏障受損也會增加腸道炎癥的易感性.IAP主要在十二指腸中表達(dá), 而空腸和回腸的AKP mRNA水平和酶活性顯著降低.IAP的最適pH值＞8, 其表達(dá)量及酶的活性最高[28], 十二指腸長期暴露在胃液及食糜下,十二指腸上皮細(xì)胞通過分泌HCO3－形成十二指腸黏膜pH梯度, 保護(hù)十二指腸黏膜[29].而IAP在其調(diào)控上可能發(fā)揮了重要作用.Mizumori等[30]研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)黏膜表面pH較低時, 降低了IAP所具有的ATP酶活性, 細(xì)胞外堆積的ATP刺激腸上皮細(xì)胞分泌HCO3－, 結(jié)合腸道內(nèi)的H+合成碳酸釋放CO2, 后者擴(kuò)散入腸上皮細(xì)胞, 在碳酸酐酶的作用下重新合成HCO3－進(jìn)入腸腔, 升高腸道pH, 同時IAP的ATP酶活性也隨之升高.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論提示IAP作為腸道pH調(diào)節(jié)的堿性傳感器, 在調(diào)節(jié)腸黏膜化學(xué)屏障、在改善腸內(nèi)酸堿環(huán)境維持腸道穩(wěn)態(tài), 維持腸黏膜屏障功能的關(guān)鍵作用.

2.4 IAP調(diào)節(jié)腸黏膜生物屏障 腸黏膜生物屏障的完整對維持腸道共生菌穩(wěn)態(tài)及抑制腸道炎癥具有重要的作用.IAP在維持腸道共生菌的穩(wěn)定中表現(xiàn)出了一定的作用, 在調(diào)節(jié)腸道菌群種類, 抑制菌群位移上發(fā)揮作用[31](圖1).

LPS存在于腸道細(xì)菌的細(xì)胞壁, AKP對LPS去磷酸化降低其毒性的能力似乎是一種保守進(jìn)化的功能, 在最近研究涉及的無脊椎動物魷魚-弧菌共生模型共生識別和穩(wěn)態(tài)中也發(fā)現(xiàn)了這點(diǎn).隨著人們對動物是由微生物一步步演化發(fā)展而來的這一認(rèn)識越來越清晰[32], 這種生物繼續(xù)進(jìn)化的能力造就了動物內(nèi)源性微生物種群和功能的多樣性.事實(shí)上, 已有研究證明IAP表達(dá)的變化會影響腸道微生物菌群組成[33], Wang等[34]的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn), 運(yùn)用熒光標(biāo)記的兩種大腸桿菌予小鼠口服構(gòu)建腹膜炎模型, 并予以IAP干預(yù), 檢測細(xì)菌移植, 證實(shí)外源性IAP能夠抑制腹膜炎模型小鼠炎癥反應(yīng), 并抑制腸道細(xì)菌位移, 同時闡明了IAP發(fā)揮作用的分子機(jī)制, 檢測細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulatory protein kinase, ERK)磷酸化水平和ERK-特異性蛋白-1(specificity protein 1,SP-1)-血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和ERK-尾型同源異型核基因2(caudal type homeobox transcription factor 2, Cdx-2)-緊密連接蛋白2(Claudin-2)通路蛋白的表達(dá)水平, 發(fā)現(xiàn)IAP抑制了Claudin-2和VEGF的表達(dá), 降低了腸黏膜通透性, 并通過維持腸黏膜屏障功能穩(wěn)定來抑制腸道菌群位移(圖2).

圖2 刷狀緣IAP發(fā)揮作用的分子機(jī)制.IAP首先降低ERK磷酸化水平, 進(jìn)而下調(diào)ERK下游的轉(zhuǎn)錄因子SP-1.隨后SP-1與VEGF啟動子的結(jié)合減少, 降低VEGF基因啟動子的活性, 最終VEGF表達(dá)降低.同時,IAP使ERK去磷酸化, 進(jìn)一步減低下游與Claudin-2啟動子結(jié)合的尾型同源異型核基因2分子數(shù)量, 最終形成通道的Caudin-2蛋白表達(dá)下降.IAP：腸堿性磷酸酶； ERK：細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶； SP-1：特異性蛋白-1； VEGF：血管內(nèi)皮生長因子； Claudin-2：緊密連接蛋白-2.

Malo等[35]研究發(fā)現(xiàn), IAP基因敲除小鼠, 在腸局部或遠(yuǎn)處缺血損傷時, 細(xì)菌轉(zhuǎn)移到腸系膜淋巴結(jié)的數(shù)量增加, IAP這一作為腸道黏膜防御因子的特性與腸道微生物群存在潛在相互作用.IAP的作用在于維持腸道微生物群的正常穩(wěn)態(tài), 具有預(yù)防和治療因致病菌引起的菌群失調(diào)和腸道感染的潛力.以上研究均證實(shí)IAP在改善腸黏膜生物屏障中發(fā)揮了作用, 并為腸道菌群失調(diào)提供了新的治療方向和廣闊的思路.

3 結(jié)語

IAP在維持腸道黏膜機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障、生物屏障的功能具有重要的作用, 對維持機(jī)體健康和腸道微生物穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用, 同時參與調(diào)控腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收.然而近年來對IAP的在腸黏膜保護(hù)作用機(jī)制的研究還不是很多, 具體機(jī)制還待繼續(xù)研究, 相信隨著人們對IAP保護(hù)腸黏膜屏障作用機(jī)制的進(jìn)一步研究, 會為改善腸道穩(wěn)態(tài)尋找到新的治療方向, 并提供更多的理論依據(jù)和更廣闊的思路.