談小龍 張黎 張佳 鄭龍龍

摘要?為了解山西某規(guī)模化豬場(chǎng)5月齡豬群副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）的敏感藥物情況，采集病死豬胸腔積液5份，通過(guò)細(xì)菌染色、形態(tài)觀察、PCR檢測(cè)，從胸腔積液樣品中檢測(cè)出5株Hps，根據(jù)其藥物敏感特性推測(cè)其為同一菌株，將其命名為Hps-SX19。此次試驗(yàn)獲得的Hps菌株為超級(jí)耐藥株，該菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類、截短側(cè)耳素類、林可胺類藥物敏感，對(duì)氨基糖苷類、氯霉素類、喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性，給生產(chǎn)上敏感藥物的選擇帶來(lái)了巨大的困擾，降低了豬群的整體健康情況，為非洲豬瘟進(jìn)場(chǎng)提供了便利，可能會(huì)帶來(lái)巨大損失。

關(guān)鍵詞?Hps;K-B法;敏感藥物;超級(jí)細(xì)菌

中圖分類號(hào)?S859文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）22-0085-03

Abstract?In order to understand the sensitive drug situation of Haemophilus parasuis（Hps） in a 5monthold pig herd of a largescale pig farm in Shanxi Province，5 samples of pleural effusion were collected from sick and dead pigs. 5 strains of Hps were detected in pleural effusion samples by using bacterial staining， morphological observation and PCR detection. Based on its drug sensitivity characteristics， it was speculated to be the same strain，named as HpsSx19. Hps strain obtained in this experiment was a super drugresistant strain， which was sensitive to lacta mines， pleurotropin and lincomyla mine， and it was resistant to a minoglycosides， chloramphenicol and quinolones， which brought great troubles to the selection of sensitive drugs in the production， reduced the overall health status of swine herd， facilitated the occurrence of African swine fever， and brought huge losses.

Key words?Hps;KB method; Sensitive drugs;Super bacteria

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）常引起纖維素性肺炎、關(guān)節(jié)炎為主要癥狀的一種細(xì)菌性傳染病，以高發(fā)病率和高死亡率為特征，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p失，因此應(yīng)對(duì)此病引起高度重視。38.9%～77.8%的健康豬攜帶Hps致病菌[1-2]，2～8周齡的青年豬易感，發(fā)病率一般為10%～20%，嚴(yán)重時(shí)死亡率在50%以上[3-4]。

2019年3月山西省一家規(guī)?；蕡?chǎng)5月齡開(kāi)始發(fā)病，精神沉郁、食欲廢絕，體溫 41?℃，呼吸困難，呈腹式呼吸。胸腔、心包及腹腔有多量纖維性滲出物，可見(jiàn)絨毛心;全身淋巴結(jié)腫大、暗紅色，切面呈大理石花紋樣。筆者對(duì)豬高熱病副豬嗜血桿菌的感染進(jìn)行了初步研究，分離、鑒定了5株副豬嗜血桿菌，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，旨在為指導(dǎo)豬場(chǎng)合理用藥、控制和治療高熱病繼發(fā)感染該病提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?樣品來(lái)源。2019年3月無(wú)菌采集來(lái)自山西省某規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)急性死亡、纖維素性心包炎豬的胸腔積液及肺臟5份。

1.1.2?試驗(yàn)材料。巧克力瓊脂、血瓊脂、Hps陽(yáng)性菌株、金黃色葡萄球菌、麥?zhǔn)媳葷峁艿?，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2?方法

1.2.1?分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特性檢查。參考GB/T 34750—2017 《副豬嗜血桿菌檢測(cè)方法》，無(wú)菌采集肺臟、胸腔積液接種于巧克力瓊脂平板、血瓊脂平板， 37?℃ 5 %～10 % CO2 培養(yǎng) 36 h 后，觀察其在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)、菌落特征以及在血瓊脂平板上的溶血性等培養(yǎng)特性。

1.2.2?衛(wèi)星現(xiàn)象檢查。將鮮血瓊脂平皿用無(wú)菌棉簽均勻涂布此次分離的細(xì)菌，在其中一部分劃線接種金黃色葡萄球菌， 37?℃下培養(yǎng)36 h，觀察其是否在葡萄球菌周圍出現(xiàn)“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

1.2.3?PCR鑒定。將分離純化的菌株用接種環(huán)挑取菌落接種于含5 mL無(wú)菌不含瓊脂的巧克力液體培養(yǎng)基玻璃管中，37 ℃ 5 %～10 %CO2 培養(yǎng) 36 h 后，使用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度至1.5×108個(gè)/mL，取1 mL菌液10 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沸水中水浴10?min，10 000 r/min離心5 min取上清作為PCR模板。根據(jù)副豬嗜血桿菌OmpP5基因（M75065）序列設(shè)計(jì)引物[5]，由上海生工生物技術(shù)公司合成。P1為5′-GTGATGAGGAAGGGTGGGT-3′，P2為5′-GGCI'CGACCCTCTGT-3′;其中10×PCR Buffer 2.5?μL，dNTP Mixture 1?μL，上游和下游引物終濃度為0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板300 ng（1.5～2.0 μL），加水補(bǔ)足25 μL。PCR條件如下：94 ℃5 min;94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃60 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃30 s。取8 μL PCR產(chǎn)物與適量上樣緩沖液混合后，在120 V電壓條件下用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳30 min后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4?動(dòng)物致病性試驗(yàn)。將分離菌株接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，取1.0 mL接種于2月齡小鼠腹腔中，設(shè)置空白對(duì)照組。接種后連續(xù)7 d，每天3次觀察小鼠狀況。

1.2.5?藥敏試驗(yàn)。將分離菌株接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，使用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度至1.5×108個(gè)/mL。按照常規(guī)細(xì)菌接種方法取100 μL菌液均勻涂抹在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，并貼上標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片（直徑6 mm），在4 ℃條件下放置30 min。然后，再移入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑，最后根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2?結(jié)果與分析

2.1?分離菌株的培養(yǎng)特性?分離菌株在巧克力培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后生長(zhǎng)良好，形成針尖大小菌落，釣取菌落進(jìn)行染色并鏡檢，發(fā)現(xiàn)分離菌株符合副豬嗜血桿菌的形態(tài)和染色特征。在普通肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)36 h后未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。在血平板上培養(yǎng) 36 h后，可見(jiàn)有針尖大小、圓形、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落生長(zhǎng)，不表現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

2.2?致病性試驗(yàn)結(jié)果?小鼠接種菌液16～36 h 內(nèi)全部死亡，對(duì)照組無(wú)異常，取其胸腔積液接種于巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，分離到同樣的細(xì)菌。

2.3?PCR鑒定結(jié)果?豬場(chǎng)分離到的致病性Hps基因進(jìn)行

PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳獲得大小約380 bp的特異性目的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.4?藥敏試驗(yàn)結(jié)果?此次獲得的Hps-SX19菌株為超級(jí)耐藥株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類第三代頭孢類藥物頭孢曲松和頭孢噻肟、截短側(cè)耳素類（泰妙菌素）、林可胺類（大觀霉素）藥物敏感，對(duì)β-內(nèi)酰胺類氨芐西林和阿莫西林、氨基糖苷類（新霉素）、四環(huán)素類（土霉素、強(qiáng)力霉素）、氯霉素類（氟苯尼考）、喹諾酮類（恩諾沙星、環(huán)丙沙星）藥物產(chǎn)生耐藥性（表1）。

3?結(jié)論與討論

我國(guó)養(yǎng)豬環(huán)境差，疾病防控壓力大，因此常選用抗生素廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床保健，已經(jīng)是治療豬疾和保障生產(chǎn)的重要工具;由于抗生素的頻繁使用，導(dǎo)致大量細(xì)菌耐藥菌株的持續(xù)出現(xiàn)，給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來(lái)了巨大危害，但目前尚未發(fā)現(xiàn)完全耐藥的超級(jí)細(xì)菌[6-10]，處于可控范圍內(nèi)，因此持續(xù)跟蹤當(dāng)前敏感藥物及回顧性研究耐藥性，對(duì)于提高生產(chǎn)成績(jī)、食品安全具有十分重要的意義。

Hps是豬上呼吸道的常見(jiàn)菌，該病的治療效果較差，預(yù)防才是上策，該病通常是作為繼發(fā)或并發(fā)感染發(fā)生的，常伴有支原體、附紅細(xì)胞體的混合感染。通常情況下，疫苗是疾病預(yù)防的首選，但對(duì)該菌作用甚微，有很多分離株不能被分型，目前已經(jīng)投入使用的疫苗對(duì)豬群免疫后雖然能夠提高豬群對(duì)副豬嗜血桿菌的抵抗力，大大降低了豬群暴發(fā)或繼發(fā)副豬嗜血桿菌的概率[11-14];但隨著非洲豬瘟的肆虐，疾病更加復(fù)雜化，豬群抵抗力可能因?yàn)檫^(guò)度消毒而降低，造成Hps防控壓力更大，因此需要多種方案共同作用。

該研究對(duì)分離到的Hps-SX19株進(jìn)行了7類12種抗生素的藥物敏感性分析，結(jié)果表明致病性Hps-SX19株對(duì)β-內(nèi)酰胺類第三代頭孢類藥物、截短側(cè)耳素類泰妙菌素、林可胺類大觀霉素）藥物敏感，對(duì)β-內(nèi)酰胺類氨芐西林、阿莫西林、氨基糖苷類新霉素、四環(huán)素類土霉素、強(qiáng)力霉素、氯霉素類氟苯尼考、喹諾酮類恩諾沙星、環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性，呈現(xiàn)出多重耐藥性。

該研究從藥物敏感性的角度對(duì)Hps進(jìn)行了初步研究，通過(guò)分離和鑒定發(fā)病豬場(chǎng)致病菌，并對(duì)分離株Hps-SX19進(jìn)行敏感藥物性篩選，為進(jìn)一步跟蹤山西規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)生Hps的復(fù)雜病因和臨床用藥提供一定的科學(xué)參考。

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