徐 偉，袁 群，高志山，于顥彪，孫一峰，屈 藝

(1.南京理工大學(xué) 電子工程與光電技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210094；2.南京理工大學(xué) 自動(dòng)化學(xué)院，江蘇 南京 210094)

引言

1590年，荷蘭工匠Z.Janssen發(fā)明了第一臺(tái)光學(xué)顯微鏡，突破了人眼所能觀察的極限。自此之后，光學(xué)顯微鏡打開了人類探索微觀世界的大門，逐漸在生命學(xué)、醫(yī)學(xué)、制造、材料等領(lǐng)域成為不可或缺的工具。

微納制造技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，以及生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)τ谖⒂^世界的探索，對(duì)于顯微成像系統(tǒng)的成像分辨率提出了更高的要求[1]。但是，由于衍射極限的存在，在可見光波段傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡無法觀測(cè)特征尺寸小于200 nm的結(jié)構(gòu)[2]，很大程度上限制著生命科學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展[3]。在微納制造領(lǐng)域，臺(tái)積電已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了7 nm的麒麟980芯片的量產(chǎn)。由此可見，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足現(xiàn)階段的檢測(cè)需求。

攜帶物體高頻信息的信號(hào)丟失，被認(rèn)為是衍射極限存在的原因。倏逝波的存在，為突破衍射極限提供了可能，倏逝波的波數(shù)大于傳導(dǎo)波，能夠攜帶高頻的信息，通過收集倏逝波，獲取高頻信息，可以實(shí)現(xiàn)更高的成像分辨率[4]。1972年，人們首次通過近場(chǎng)掃描顯微鏡(near-field scanning microscopy)，獲得了基于倏逝波的超分辨顯微圖像[5]，證實(shí)了這一方案的可行性。但是，倏逝波的振幅在振動(dòng)方向上呈指數(shù)衰減，傳播距離只有入射波長(zhǎng)量級(jí)[6]。因此，成像透鏡必須要放置在待測(cè)樣品的近場(chǎng)區(qū)，這大大限制了該技術(shù)的使用。

2011年，英國(guó)曼徹斯特大學(xué)的王增波等人在Nature Communications上首次發(fā)表了微球透鏡超分辨顯微成像的結(jié)果[7]。他們將二氧化硅微球無浸液地放置在樣品表面，在傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡下觀察樣品，將可見光波段光學(xué)顯微鏡的成像分辨率提升到50 nm(見圖1(a))。這種簡(jiǎn)單有效的超分辨顯微成像方案迅速得到了國(guó)內(nèi)外研究小組的關(guān)注，他們圍繞成像方案、成像機(jī)制等方面開展了大量研究工作。本文將從多方面總結(jié)比對(duì)微球透鏡的二維超分辨顯微成像技術(shù)，并介紹微球與干涉顯微技術(shù)相結(jié)合帶來的三維超分辨形貌檢測(cè)技術(shù)，就此展開討論。

1 微球透鏡二維超分辨顯微成像方案

1.1 微球透鏡參數(shù)及浸沒方式

基于微球透鏡的超分辨顯微成像方案是通過將微球放置在待測(cè)樣品表面，利用顯微鏡透過微球觀察樣品，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品表面結(jié)構(gòu)的超分辨顯微成像。如圖1所示，微球透鏡的顯微成像方案主要有無浸液[7]、半浸液[8]、完全浸液[11]3種。

2011年，英國(guó)曼徹斯特大學(xué)的王增波等人將二氧化硅微球無浸液地播灑在陽(yáng)極氧化鋁(AAO)樣品表面，在放大率80×、NA=0.9的光學(xué)顯微鏡下，觀察到孔徑為50 nm的AAO樣品結(jié)構(gòu)[7]。成像方案如圖1(a)所示，成像結(jié)果如圖2所示。

圖1 微球透鏡顯微成像方案Fig.1 Microsphere lens microimaging scheme

圖2 AAO樣品成像結(jié)果Fig.2 AAO sample imaging results

同年，浙江大學(xué)的劉旭課題組在二氧化硅微球透鏡超分辨顯微成像的研究中，對(duì)比無浸液方案(圖1(a))和液體半浸沒的方案(圖1(b))，發(fā)現(xiàn)乙醇半浸沒的顯微成像方案獲得的結(jié)果放大倍率小，但是圖像的對(duì)比度顯著增強(qiáng)[8]，成像結(jié)果如圖3所示。

圖3 二氧化硅微球透鏡下的成像結(jié)果Fig.3 Imaging results under silicon dioxide microsphere lens

2012年，美國(guó)北卡大學(xué)夏洛特分校的A. Darafsheh課題組對(duì)高折射率微球進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。他們將直徑為53 μm，折射率為2.1的鈦酸鋇微球撒在藍(lán)光光盤表面，在放大率20×、NA=0.4的顯微物鏡下，觀察到寬度為200 nm、間距為100 nm的藍(lán)光光盤表面結(jié)構(gòu)[9]。

2013年，Seoungjun Lee將折射率為1.59的聚苯乙烯微球無浸液地撒在藍(lán)光光盤表面，在放大率50×、NA=0.75的光學(xué)顯微物鏡下，成功觀測(cè)到藍(lán)光光盤表面結(jié)構(gòu)[10]。2013年，Lin Li將折射率為1.9的鈦酸鋇微球去離子水完全浸沒在藍(lán)光光盤表面，在放大率50×、NA=0.75的顯微物鏡下，成功觀測(cè)到藍(lán)光光盤結(jié)構(gòu)[11]。

2014年Arash Darafsheh課題組對(duì)比了兩種顯微成像方案——鈉鈣玻璃微球(n=1.51)無浸液的方案與鈦酸鋇微球(n=2.1)異丙醇浸沒的方案，發(fā)現(xiàn)鈦酸鋇微球異丙醇浸沒的方案下能獲得更好的圖像質(zhì)量[12]，成像結(jié)果如圖4所示。

圖4 兩種方案下的成像結(jié)果Fig.4 Imaging results under two scenarios

此外，Arash Darafsheh對(duì)不同倍率和數(shù)值孔徑的顯微物鏡進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，微球結(jié)合放大率20×、NA=0.4的物鏡相比于微球結(jié)合放大率100×、NA=0.9的物鏡成像更清晰，對(duì)比圖如圖5所示。

圖5 不同成像方案下的樣品圖Fig.5 Sample diagrams under different imaging schemes

采用液體浸沒微球時(shí)，由于液體容易揮發(fā)，浸沒液高度變化，導(dǎo)致獲得的圖像變化，無法長(zhǎng)時(shí)間觀察。2015年Arash Darafsheh利用PDMS薄膜固體浸沒鈦酸鋇微球，解決了液體浸沒無法長(zhǎng)時(shí)間觀察的難題，裝置方案如圖6所示[13]。

圖6 鈦酸鋇微球浸沒在PDMS薄膜中的成像方案Fig.6 Imaging scheme under barium titanate microsphere immersion in PDMS film

2016年，南京師范大學(xué)的郭明磊在研究鈦酸鋇微球透鏡超分辨顯微成像時(shí)，發(fā)現(xiàn)微球直徑對(duì)成像質(zhì)量有一定的影響[14]。微球直徑在5 μm～20 μm之間時(shí)，具有最佳的圖像對(duì)比效果，藍(lán)光光盤樣品的條紋可以清晰地分辨。直徑大于20 μm時(shí)，圖像對(duì)比度下降。

國(guó)內(nèi)外不同實(shí)驗(yàn)方案下獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。在樣品表面播撒低折射率微球和高折射率微球，在顯微鏡下都可以實(shí)現(xiàn)超分辨顯微成像，但是微球折射率和直徑、浸沒方式、浸沒液折射率以及顯微物鏡的放大倍率和數(shù)值孔徑這些因素都會(huì)影響微球透鏡超分辨顯微成像的質(zhì)量。當(dāng)微球折射率低于1.8時(shí)，無需浸液即可實(shí)現(xiàn)超分辨顯微成像。當(dāng)微球折射率高于1.8時(shí)，只有在液體浸沒的情況下才能獲得超分辨顯微成像結(jié)果。而且高折射率微球完全浸沒的成像方案相比于低折射率微球無浸液的方案，獲得的圖像更清晰。

表1 不同成像方案下的結(jié)果Table 1 Results under different imaging scenarios

本課題組將折射率為1.5的三聚氰胺甲醛微球完全浸沒在PDMS中觀察藍(lán)光光盤，獲得了清晰的成像結(jié)果。而且通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，口徑11 μm的三聚氰胺甲醛微球浸沒在PDMS中的超分辨成像質(zhì)量?jī)?yōu)于口徑27 μm的鈦酸鋇微球浸沒在PDMS中的成像質(zhì)量。這一結(jié)果表明低折射率微球全浸沒這一成像方案也可以獲得較好的超分辨成像質(zhì)量，結(jié)果如圖7所示。

圖7 微球PDMS膜完全浸沒下觀察的藍(lán)光光盤成像結(jié)果Fig.7 Blue disc imaging resultsunder complete immersion of microsphere PDMS film

1.2 成像分辨率及放大倍率

如表1所示，王增波、李林等人分別利用二氧化硅微球和鈦酸鋇微球，將光學(xué)顯微成像的分辨力提高到50 nm[7，11]。Hok Sum Sam Lai利用鈦酸鋇微球，將分辨率提升到40 nm[15](圖8白色箭頭所指位置)。此外，研究人員還對(duì)間距為100 nm的藍(lán)光光盤、直徑為280 nm的聚苯乙烯微球陣列、特制的納米柱等多種樣品進(jìn)行超分辨成像實(shí)驗(yàn)研究。微球透鏡超分辨顯微成像技術(shù)不僅能夠用于觀測(cè)金屬結(jié)構(gòu)的樣品，還可以觀察非金屬結(jié)構(gòu)，甚至用于觀察活體病毒[11]，應(yīng)用范圍廣泛，而且可以實(shí)現(xiàn)約λ/7的成像分辨率[12]。

圖8 40 nm間距的CPU成像結(jié)果Fig.8 CPU imaging results at 40 nm spacing

在放大倍率的研究上，王增波在改變二氧化硅微球的直徑時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著微球直徑的增加，成像放大率也顯著增加[7]，如圖9所示。同年，劉旭課題組發(fā)現(xiàn)乙醇半浸沒二氧化硅微球時(shí)，放大倍率減小[13]。2012年，Arash Darafsheh課題組將不同直徑的鈦酸鋇微球浸沒在異丙醇中，對(duì)金納米顆粒二聚體NPD成像[9]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示。當(dāng)微球直徑小于10 μm時(shí)，隨著直徑增大，放大倍率增大；當(dāng)微球直徑大于10 μm時(shí)，隨著直徑增大，放大倍率減小。

圖9 二氧化硅微球直徑與成像放大倍率之間的關(guān)系Fig.9 Relationship between diameter of silicon dioxide microsphere and magnification of imaging

圖10 鈦酸鋇微球直徑與放大倍率之間的關(guān)系Fig.10 Relationship between diameter of barium titanate microsphere and magnificationof imaging

2015年中國(guó)科學(xué)院光電技術(shù)研究所龐輝分別利用5 μm的二氧化硅微球、20 μm的鈦酸鋇微球，結(jié)合放大率100×、NA=0.9的顯微物鏡，將二氧化硅微球半浸沒、鈦酸鋇微球完全浸沒在不同折射率的介質(zhì)層中，發(fā)現(xiàn)介質(zhì)層的折射率越小，成像的放大倍率越大[16]，結(jié)果如表2所示。

表2 不同浸沒液折射率下的放大倍率Table 2 Magnification of different immersed fluid refractive indicators

在微球透鏡成像放大倍率的實(shí)驗(yàn)研究中，研究人員依據(jù)各自的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬合放大倍率曲線。2011年，王增波在對(duì)二氧化硅微球放大倍率研究中，擬合的公式為M=(Imax/I0)β，其中，β≈0.34。2016年，王飛飛將實(shí)驗(yàn)研究獲得的放大倍率進(jìn)行曲線擬合，獲得了擬合公式[1]：

M≈k×fFDTD/(fFDTD-(D/2+Δz))

(1)

式中：fFDTD為時(shí)域有限差分算法仿真的焦距；D為直徑；Δz為樣品與微球之間的間隔；k為系數(shù)。

如表3所示，由于微球折射率及直徑、成像樣品、浸沒方式、浸沒液折射率等方面的不同，實(shí)驗(yàn)獲得的成像放大倍率有所不同。王增波根據(jù)二氧化硅微球的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以聚焦光強(qiáng)的指數(shù)倍來擬合放大倍率。王飛飛采用微球直徑、樣品與微球的距離、仿真出來的焦距為變量來擬合放大倍率。由于變量設(shè)置的不同，獲得的擬合公式差別很大，并且擬合的依據(jù)只是研究人員幾個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下數(shù)據(jù)，在其他條件下是否符合尚未驗(yàn)證。目前而言，尚未有統(tǒng)一的公式能完全擬合出系統(tǒng)的放大倍率。

表3 二氧化硅微球在不同直徑、樣品、物鏡、浸沒方式下對(duì)應(yīng)的放大倍率Table 3 Corresponding magnification of silicon dioxide microspheres in different diameters, samples, objective lens, immersion modes

1.3 成像視場(chǎng)限制與拓展

微球透鏡超分辨顯微成像技術(shù)雖然突破了衍射極限，提高了成像的橫向分辨率，但是微球透鏡超分辨顯微成像技術(shù)的成像視場(chǎng)局限于幾μm到十幾μm[9]，如圖11所示。而且，隨著微球直徑的增加，微球透鏡超分辨成像的清晰度變差，單個(gè)微球視場(chǎng)僅限于十幾μm，存在物鏡全視場(chǎng)浪費(fèi)的問題。

圖11 成像視場(chǎng)與微球直徑之間的關(guān)系Fig.11 Relationship between imaging field of view and microsphere diameter

目前，在微球透鏡超分辨實(shí)驗(yàn)研究中，微球主要是以隨機(jī)分散的方式置于樣品表面。為了擴(kuò)大成像視場(chǎng)，研究人員利用鎢探針[17]、毛細(xì)玻璃管[18]、PDMS薄膜[19]、微球機(jī)器人[20]、AFM探針[21]等方法，將微球移動(dòng)到待觀測(cè)目標(biāo)區(qū)域，獲取圖像結(jié)果后通過移動(dòng)微球拼接成像結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)視場(chǎng)擴(kuò)大。這些掃描方式雖然實(shí)現(xiàn)了視場(chǎng)的擴(kuò)大，但是存在掃描效率低的問題。

為此，研究人員開展了微球透鏡陣列的制備技術(shù)研究。王飛飛總結(jié)了兩種通過調(diào)制界面不穩(wěn)定來實(shí)現(xiàn)微球透鏡陣列制造的方法——基于光誘導(dǎo)電流體動(dòng)力學(xué)的微納制造方法和基于機(jī)械調(diào)制界面不穩(wěn)定的微納制造方法，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)微球透鏡陣列可以實(shí)現(xiàn)良好的成像效果[22]，結(jié)果如圖12所示。除此之外，還有自集合旋涂法[23]、玻璃基底吸附旋涂法[24]，以及沉積掩膜刻蝕[25]等微球陣列的制備方法。

圖12 微球陣列及成像結(jié)果Fig.12 Microsphere array and imaging results

此外，研究人員利用微柱透鏡超分辨顯微成像來獲得更大的成像視場(chǎng)。2016年，英國(guó)班戈大學(xué)James N. Monks采用微柱[26]結(jié)合光學(xué)顯微鏡，在反射模式下獲得了藍(lán)光光盤的表面結(jié)構(gòu)，成像結(jié)果如圖13所示。微柱透鏡相比于微球，成像視場(chǎng)更大。但是，由于制作困難，對(duì)于微柱透鏡的研究較少。將微柱與陣列相結(jié)合，有序排布微柱透鏡，制作微柱陣列PDMS膜蓋玻片，是打破成像視場(chǎng)限制的一種有效手段。

圖13 微柱對(duì)藍(lán)光光盤成像結(jié)果Fig.13 Imaging results of microcolumnto blue-ray disc

2 微球透鏡超分辨顯微成像機(jī)理

通過微球透鏡超分辨顯微成像技術(shù)，科研人員在可見光波段獲得了最高40 nm的成像分辨率，突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡200 nm的衍射極限，提升了光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率。但是，在微球透鏡超分辨成像機(jī)理上，尚未有理論能完全解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

2.1 幾何光學(xué)分析

2012年，浙江大學(xué)的王淑瑩采用幾何光學(xué)的方式分析微球透鏡的顯微成像機(jī)理[27]，將微球看成是一個(gè)透鏡。樣品經(jīng)過微球放大之后，被顯微鏡二次放大。這就解釋了微球的放大作用。

圖14 成像示意圖 Fig.14 Imaging schematics

2014年，南京師范大學(xué)的葉燃采用Zemax軟件對(duì)微球透鏡顯微成像進(jìn)行了仿真，發(fā)現(xiàn)Zemax軟件仿真的成像倍率以及焦距與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差較大[28]。由于微球直徑在波長(zhǎng)量級(jí)，光的散射無法忽略，所以利用幾何光學(xué)分析微球透鏡顯微成像不夠準(zhǔn)確。此外，利用幾何光學(xué)的知識(shí)，無法解釋衍射極限的突破現(xiàn)象，所以幾何光學(xué)無法解釋微球透鏡超分辨顯微成像機(jī)理。

2.2 倏逝波傳輸

衍射極限的存在，導(dǎo)致傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡無法觀察200 nm以下的微觀物體。攜帶物體高頻信息的信號(hào)丟失，被認(rèn)為是衍射極限存在的原因。當(dāng)光波從光密介質(zhì)入射到光疏介質(zhì)且入射角大于臨界角時(shí)，發(fā)生全內(nèi)反射，但仍有一部分光場(chǎng)將穿過界面進(jìn)入到光疏介質(zhì)一側(cè)，其振幅隨著與分界面垂直距離的增大而呈指數(shù)形式衰減，這部分光場(chǎng)稱之為倏逝波。倏逝波的波數(shù)大于傳導(dǎo)波，能夠攜帶高頻的信息。通過收集攜帶高頻信息的倏逝波，可以實(shí)現(xiàn)更高的分辨率。

在近場(chǎng)中傳播的倏逝波，經(jīng)過微球透鏡轉(zhuǎn)換為傳輸波，可傳輸?shù)竭h(yuǎn)場(chǎng)，被傳統(tǒng)的光學(xué)顯微系統(tǒng)所接收，從而實(shí)現(xiàn)超分辨顯微成像。

2.3 納米噴射效應(yīng)

2004年，美國(guó)西北大學(xué)Zhigang Chen發(fā)現(xiàn)，當(dāng)平行光照射微米級(jí)介電圓柱和微球時(shí)，介電圓柱和微球?qū)⑷肷淦叫泄馐劢钩蓙啿ㄩL(zhǎng)量級(jí)的光束，這一現(xiàn)象被稱為光子納米噴射效應(yīng)[29]。2008年，F(xiàn)errand等人通過針孔濾波的快速掃描共聚焦顯微鏡，直接實(shí)驗(yàn)證實(shí)了微球產(chǎn)生的光子納米噴流的存在[30]。針對(duì)這一效應(yīng)，研究人員對(duì)其特性、潛在應(yīng)用等進(jìn)行了研究。

平行光束經(jīng)介電圓柱或者微球聚焦成亞波長(zhǎng)量級(jí)的光束，如圖15所示。對(duì)該光束，我們通過半高全寬、光強(qiáng)最大值、焦點(diǎn)(光軸上光強(qiáng)最大值對(duì)應(yīng)的點(diǎn))、噴射長(zhǎng)度等參數(shù)表征。其中，光軸上光強(qiáng)最大值對(duì)應(yīng)的點(diǎn)即為焦點(diǎn)，從微球的球心到焦點(diǎn)的距離為微球透鏡的焦距。噴射長(zhǎng)度定義為從光強(qiáng)最大值點(diǎn)沿軸方向光強(qiáng)衰減到1/e2的距離，半高全寬為在光強(qiáng)最大值處，垂直于光軸方向上光強(qiáng)最大值的一半對(duì)應(yīng)的距離。

光子納米噴射效應(yīng)的特點(diǎn)為[31]：1) 它是一種非漸逝的傳播光束，可以保持亞波長(zhǎng)半高全寬(FWHM)傳輸；2) 其最小FWHM波束寬度可小于經(jīng)典衍射極限，實(shí)際上可以達(dá)到λ/3；3) 它的強(qiáng)度很高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過照射波的強(qiáng)度。

圖15 光子納米噴射的參數(shù)表征Fig.15 Parametric representation of photon nanoinjection

研究人員通過米氏散射和時(shí)域有限差分算法，利用仿真軟件(FDTD、CST、COMOL)對(duì)光子納米噴射效應(yīng)進(jìn)行研究，以此來研究微球透鏡超分辨現(xiàn)象。

2005年，美國(guó)西北大學(xué)的Xu Li用FDTD軟件，二維仿真研究平行光經(jīng)過微柱之后的匯聚情況，三維仿真研究平行光經(jīng)過微球之后的匯聚情況[32]。仿真結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與二維仿真情況相比，三維仿真下獲得的納米噴射的強(qiáng)度和后向散射增強(qiáng)能力都高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)，可見微球的匯聚結(jié)果比微柱效果好。這和實(shí)驗(yàn)中利用微球透鏡獲得的超分辨圖像成像質(zhì)量比微柱透鏡更好的現(xiàn)象吻合。

2005年，法國(guó)光學(xué)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的Sylvain Lecler研究折射率和微球半徑對(duì)光子納米噴射的影響[33]。發(fā)現(xiàn)平行光經(jīng)過高折射率微球時(shí)，焦點(diǎn)(光軸上強(qiáng)度最大的點(diǎn))在球體內(nèi)部，沒有超分辨現(xiàn)象，當(dāng)平行光經(jīng)過低折射率微球時(shí)，焦點(diǎn)在微球外部，存在超分辨現(xiàn)象。仿真結(jié)果如圖16所示。這一仿真結(jié)果解釋了低折射率微球無浸液的方案下能夠獲得超分辨圖像，高折射率微球在無浸液的方案下無超分辨成像這一現(xiàn)象。

2008年，Patrick Ferrand通過實(shí)驗(yàn)，證實(shí)平行光經(jīng)過微球透鏡產(chǎn)生的光子納米噴射效應(yīng)不存在相互作用[34]。2011年，Myun-Sik Kim測(cè)量了光子納米噴射的半高全寬，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和仿真結(jié)果誤差在5%以內(nèi)[30]。

2013年，王增波組的Lee利用3種不同折射率的浸沒液浸沒鈦酸鋇微球(水、糖、物鏡油)(1.33，1.399，1.518)，發(fā)現(xiàn)浸沒液折射率減小，成像放大倍率以及分辨率會(huì)增加[35]。通過軟件模擬，發(fā)現(xiàn)最大強(qiáng)度位置(MIP)可以影響成像。當(dāng)MIP接近微球時(shí)，分辨率和放大率會(huì)增加，這將導(dǎo)致足夠的能量聚焦在光子納米噴射上，結(jié)果如圖17所示。

圖16 平行光經(jīng)過微球后的匯聚Fig.16 Convergence of parallel light after passing microsphere

由此可見，利用時(shí)域有限差分算法對(duì)于光子納米噴射效應(yīng)進(jìn)行仿真，與實(shí)驗(yàn)中獲得的光子納米噴射的半高全寬基本一致，它為光子納米噴射效應(yīng)的研究提供了完整的電磁場(chǎng)圖。而且通過對(duì)光子納米噴射現(xiàn)象進(jìn)行仿真，解釋了很多微球透鏡超分辨顯微成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 成像分辨率的定義與計(jì)算

通過實(shí)驗(yàn)觀測(cè)，研究人員得到微球透鏡超分辨顯微成像的分辨率λ/7。倏逝波傳輸理論和光子納米噴射效應(yīng)雖然能夠解釋微球透鏡實(shí)現(xiàn)超分辨顯微這一現(xiàn)象，但是獲得的分辨率(固體浸沒效應(yīng)λ/4，光子納米噴射效應(yīng)半高全寬λ/3～λ/2)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于實(shí)驗(yàn)室中所觀察到的分辨率(λ/6～λ/7)。由實(shí)驗(yàn)觀測(cè)得到的樣品的特征尺寸來表征超分辨成像系統(tǒng)的分辨率，這是不準(zhǔn)確的。所以，為評(píng)估微球透鏡超分辨顯微成像系統(tǒng)的分辨率，要對(duì)分辨率進(jìn)行定義和計(jì)算。

數(shù)值孔徑為NA=n0×sinθ的成像系統(tǒng)，可分辨的具有相同強(qiáng)度的點(diǎn)光源的最小間距為Kλ/NA。當(dāng)微球透鏡與樣品接觸時(shí)，由于固體浸沒效應(yīng)，微球透鏡光學(xué)衍射極限的分辨率約為λ/2ns，其中ns為微球透鏡折射指數(shù)。按此定義，微球透鏡超分辨成像的理論分辨率小于λ/4。通過譜分析發(fā)現(xiàn)，由微球透鏡所產(chǎn)的電磁場(chǎng)的頻譜可高達(dá)2k0。當(dāng)Δz<λ/2時(shí)，k0=2πnw/λ≈0.71kmax，nw為水的折射率。徑向頻率為k0～2k0時(shí)，可以將分辨率拓展1.71～2.42倍。結(jié)合微球透鏡帶來的固體浸沒效應(yīng)，理論上微球透鏡可以獲得分辨率λ/6.84～λ/9.68[36]。

圖17 100 μm BaTiO3微球浸沒在3種介質(zhì)中的匯聚情況Fig.17 100 μm BaTiO3 microsphere immersion in aggregation of three mediums

此外，由于成像系統(tǒng)所成圖像是系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)與物體強(qiáng)度分布函數(shù)的卷積，因此我們還可以通過與系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)卷積對(duì)微球透鏡的分辨率進(jìn)行估計(jì)。以掃描電子顯微鏡所測(cè)量的數(shù)據(jù)作為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定為二維矩形函數(shù)。將此函數(shù)與高斯擬合的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)進(jìn)行卷積，然后與微透鏡觀測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，從而以Houston判據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)獲得高斯函數(shù)所擬合的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的FWHM。直徑為57 μm微球的分辨率為λ/6.3。當(dāng)入射光的峰值波長(zhǎng)為550 nm時(shí)，57 μm微球的分辨率為λ/6.3。當(dāng)微球直徑降低至λ/6.3≈27 μm時(shí)，分辨率為λ/8.4≈65 nm。

通過微球透鏡的固體浸沒效應(yīng)以及譜分析可以發(fā)現(xiàn)，微球透鏡可以獲得λ/6.84～λ/9.68的分辨率。通過對(duì)系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)卷積，同樣獲得了λ/6.3～λ/8.4的分辨率[21]。這兩種方法獲得的理論分辨率與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合，因而微球透鏡的超分辨成像的分辨率可以由微球透鏡的固體浸沒效應(yīng)以及譜分析進(jìn)行理論計(jì)算分析，也可以由實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)卷積計(jì)算獲取。

3 微球透鏡三維超分辨檢測(cè)

基于微球透鏡的超分辨顯微成像技術(shù)獲得的是待測(cè)樣品表面的成像圖案，獲得了較高的橫向分辨率。干涉顯微技術(shù)利用白光的短相干特性，能夠獲得待測(cè)樣品的表面微觀形貌，其軸向分辨率可達(dá)亞納米級(jí)，但其橫向分辨率仍然受衍射極限的影響，最高僅200 nm。微球透鏡超分辨成像技術(shù)恰好可以提升橫向分辨率，因此，研究人員通過將微球透鏡與干涉顯微技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了樣品的三維形貌的超分辨檢測(cè)。

3.1 微球透鏡超分辨干涉顯微檢測(cè)光路

2016年，王飛飛將微球透鏡與Linnik型白光干涉顯微物鏡結(jié)合，在樣品表面隨機(jī)撒上鈦酸鋇微球，并用水浸沒，成功復(fù)原出周期200 nm、間隔100 nm的藍(lán)光光盤的表面結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了三維形貌測(cè)量[37]，光路圖以及三維恢復(fù)結(jié)果如圖18所示。2017年，瑞士赫爾辛基大學(xué)的I. Kassamakov采用Mirau型白光干涉顯微物鏡，利用口徑11 μm的聚合物微球，在樣品表面撒上微球無浸液的條件下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)藍(lán)光光盤的三維超分辨形貌測(cè)量[38]，光路和結(jié)果如圖19所示。

圖18 干涉顯微光路圖以及藍(lán)光光盤三維恢復(fù)結(jié)果Fig.18 Interference microscopicoptical path diagram and blue-ray disc 3D recovery results

圖19 Mirau干涉顯微光路和結(jié)果Fig.19 Optical path and results

3.2 三維形貌復(fù)原分辨率結(jié)果與分析

由于Mirau型干涉物鏡具有結(jié)構(gòu)緊湊的優(yōu)點(diǎn)，在商用白光干涉儀上廣泛采用。因此，本課題組針對(duì)微球透鏡與Mirau型干涉顯微物鏡相結(jié)合的三維超分辨檢測(cè)技術(shù)，開展了大量實(shí)驗(yàn)研究工作。

以周期為700 nm的DVD光盤為樣品，在二氧化硅微球下結(jié)合Veeco白光干涉儀使用的放大率50×、NA=0.5的Mirau型干涉物鏡，獲得了DVD光盤的干涉條紋和放大結(jié)構(gòu)?；诎坠飧缮娴南辔凰惴ǎ诤?jiǎn)單的消除球的傾斜后，獲得了DVD光盤的三維形貌，表面形貌結(jié)果如圖20所示。與AFM獲得的結(jié)果對(duì)比，發(fā)現(xiàn)高度上存在失真，AFM獲得的高度信息如圖21所示。AFM獲得的高度信息為90 nm，而經(jīng)過微球后獲得的高度僅為45 nm。因此，微球透鏡引入了較大的測(cè)量誤差。結(jié)合其他研究小組的測(cè)量，可以發(fā)現(xiàn)：在干涉顯微技術(shù)中引入微球透鏡超分辨成像技術(shù)，能夠提升橫向分辨率，但是受微球透鏡像差與超分辨效應(yīng)的影響，復(fù)原高度的信息不準(zhǔn)確，尤其是當(dāng)待測(cè)樣品的周期頻率較高時(shí)，高度信息偏差較大。微球透鏡引入的測(cè)量誤差的標(biāo)定與消除方法，是目前正在開展的研究工作。

圖20 二氧化硅微球結(jié)合50倍干涉物鏡獲得的DVD光盤高度信息Fig.20 DVD height information obtained by silicon dioxide microsphere combined with 50 times interference objective

圖21 DVD在AFM下獲得的高度信息Fig.21 High information for DVDs at AFM

針對(duì)周期為300 nm，間隔為100 nm的藍(lán)光光盤表面結(jié)構(gòu)，我們利用直徑11 μm的三聚氰胺甲醛微球，結(jié)合50倍Mirau型干涉顯微物鏡，在PDMS浸沒的條件下，觀察到了清晰的藍(lán)光光盤表面微結(jié)構(gòu)。PDMS薄膜與微球在測(cè)試光路中額外引入了光程差，造成干涉顯微物鏡中參考光路與測(cè)試光路光程不匹配。本課題組通過對(duì)干涉顯微物鏡中的參考板和分光板進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了微球超分辨成像時(shí)的光程匹配，獲得了干涉圖。干涉圖對(duì)比度約為0.75，結(jié)果如圖22所示。

圖22 微球結(jié)合干涉物鏡獲得的光盤表面結(jié)構(gòu)干涉圖Fig.22 Disc surface structure interference diagram obtained by microsphere combined with interference objective

干涉顯微物鏡系統(tǒng)主要有Mirau型、Linnik型和Michelson型3種結(jié)構(gòu)形式。其中Linnik型和Michelson型作為參考光與測(cè)試光分光路的測(cè)量系統(tǒng)，抗干擾能力差，系統(tǒng)集成難度大。研究Mirau型干涉物鏡與微球透鏡相結(jié)合實(shí)現(xiàn)超分辨三維檢測(cè)，可以以簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)的方式在商用白光顯微干涉儀上應(yīng)用推廣。雖然微球透鏡與干涉顯微物鏡相結(jié)合，目前能夠獲得微納物體的三維超分辨結(jié)構(gòu)信息，但是微球透鏡對(duì)于橫向分辨率衍射極限的突破，犧牲了白光顯微干涉術(shù)本身的高度復(fù)原精度。究其原因，從成像角度來說，干涉顯微物鏡自身是像差完善校正的元件，微球透鏡與薄膜引入了像差；從干涉角度來說微球透鏡與薄膜在測(cè)試光路中引入了額外的光程，造成干涉兩臂的光程不匹配。然而，僅從幾何光學(xué)范疇考慮微球和薄膜引入的光程問題仍不夠，因?yàn)槲⑶蛲哥R超分辨成像是在近場(chǎng)光學(xué)作用下的效果。因此，研究近場(chǎng)領(lǐng)域的像差理論，分析微球超分辨成像的作用機(jī)制，才能根本解決微球透鏡與干涉顯微物鏡相結(jié)合的諸多問題，使得微球透鏡的三維超分辨檢測(cè)獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果并具有實(shí)用價(jià)值。

4 結(jié)束語

微球透鏡與光學(xué)顯微技術(shù)相結(jié)合，可以突破衍射極限，將顯微鏡分辨率提升40 nm，由于其簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)，因此具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。通過改變微球透鏡二維超分辨顯微成像方案，可獲得更高的分辨率，更大的成像視場(chǎng)和更清晰的圖像。

在微球透鏡的超分辨成像機(jī)制上，尚未有最終定論，目前還沒有較好的理論能夠完整解釋微球透鏡的超分辨效應(yīng)。幾何光學(xué)的方法無法解釋衍射極限突破時(shí)。固體浸沒效應(yīng)和譜分析結(jié)合，以及對(duì)系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)卷積這兩種方案計(jì)算的微球透鏡分辨率和實(shí)驗(yàn)測(cè)量的結(jié)果基本符合。但是，由于微球種類、成像物鏡、成像樣品、微球直徑等方面的不同，實(shí)驗(yàn)中獲得的成像分辨率和放大倍率都有所不同。這說明除了倏逝波以及光子納米噴射效應(yīng)之外，還有其他的因素影響了微球透鏡超分辨成像。一旦把這些因素全都考慮進(jìn)去，獲得完整的微球透鏡超分辨成像機(jī)制，將大大促進(jìn)這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。

在三維形貌檢測(cè)領(lǐng)域，微球透鏡與干涉技術(shù)的結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)微觀結(jié)構(gòu)的三維超分辨形貌檢測(cè)。但是微球與薄膜在干涉光路中引入了附加光程差和成像像差，導(dǎo)致了橫向分辨率對(duì)于衍射極限突破時(shí)犧牲了白光顯微干涉術(shù)的軸向分辨率，三維形貌復(fù)原信息不準(zhǔn)確。因此，只有明確了微球透鏡的超分辨成像機(jī)制，理解了微球透鏡的作用方式，才能夠?qū)Ω缮骘@微物鏡和微球透鏡進(jìn)行聯(lián)合像差校正與干涉光路設(shè)計(jì)，在實(shí)現(xiàn)超分辨成像的同時(shí)，準(zhǔn)確獲取三維形貌信息。

此外，當(dāng)前的微球透鏡超分辨效應(yīng)的測(cè)量對(duì)象有限，主要是DVD光盤、藍(lán)光光盤、人造周期型金屬柵格結(jié)構(gòu)，還沒有能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)消費(fèi)電子類元器件樣品表面的通用測(cè)量。總的來說，現(xiàn)有的微球透鏡成像方案已經(jīng)取得了超分辨的效果，但是超分辨成像機(jī)制的完整解釋欠缺，微球透鏡近場(chǎng)域的作用關(guān)系未知，使得其在二維成像、三維檢測(cè)領(lǐng)域仍有諸多局限性。假以時(shí)日，一旦這些問題得以解決，微球透鏡超分辨成像技術(shù)簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)的本征優(yōu)勢(shì)，將在微納米元件的檢測(cè)材料科學(xué)以及生物組織成像等領(lǐng)域迎來廣闊的發(fā)展空間。