李佩雷 李紅娜 敬科舉 林潔茹 Andreea David 鄧 剛

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)院1，金華 321004) (廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院2，廈門(mén) 361005)

裂殖壺藻(Schizochytriumsp.)是一種常見(jiàn)的微藻，其生長(zhǎng)周期遠(yuǎn)低于動(dòng)物，因此通過(guò)發(fā)酵調(diào)控非常易于規(guī)?；囵B(yǎng)[1]，發(fā)酵后的藻細(xì)胞中總油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)可高于70%[2]，其中ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸特別是二十二碳六烯酸(DHA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為總油脂的30%～50%[3-4]，是一種理想的可替代深海魚(yú)油的DHA生產(chǎn)原料。隨著我國(guó)節(jié)能減排政策的推行及深化，相關(guān)環(huán)境友好的油脂綠色提取技術(shù)已成為研發(fā)熱點(diǎn)。其中，超臨界二氧化碳(scCO2)萃取工藝因其高壓、低溫、隔氧的操作環(huán)境，非常適用于提取易氧化、熱敏性的低極性脂類(lèi)物質(zhì)[5]，與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取工藝相比，不存在毒性成分殘留問(wèn)題[6]，已在微生物油脂生產(chǎn)加工領(lǐng)域顯現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用前景[7-8]。

然而，裂殖壺藻細(xì)胞中，90%以上的油脂是以甘油三酯的形式存在[9]，其分子電荷排布均勻，屬于中極性脂，并含有少量的磷脂、糖脂等極性油脂[10]。顯然，對(duì)中性脂的提取而言，純超臨界CO2并不是理想的選擇，一些研究結(jié)合使用極性的助溶劑對(duì)其進(jìn)行了改性。唐韶坤等[11]在裂殖壺藻原料中加入了等質(zhì)量的95%乙醇，先進(jìn)行了超聲波預(yù)處理，然后再用超臨界CO2進(jìn)行萃取，油脂回收率由原來(lái)的29.2%提高到75.5%；Wang等[12]則用亞臨界狀態(tài)的CO2對(duì)乙醇進(jìn)行膨脹(CO2摩爾比約為0.2)，用此類(lèi)加壓流體從裂殖壺藻中提取了油脂，雖然最終油脂回收率可達(dá)87.0%，但整體工藝乙醇用量過(guò)大，減壓回收溶劑成本偏高。本研究擬采用超臨界二氧化碳夾帶乙醇流體從裂殖壺藻細(xì)胞中提取富含DHA的微生物油脂，有關(guān)這方面研究鮮見(jiàn)報(bào)道。根據(jù)二氧化碳-乙醇?xì)庖合嗥胶庑再|(zhì)確定了夾帶劑的加量范圍；對(duì)提取過(guò)程進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了溫度、壓力、乙醇摩爾比等工藝條件；利用Peng-Robinson方程計(jì)算了混合流體密度，部分解釋了主要因素對(duì)油脂回收率的影響；最后通過(guò)氣相色譜測(cè)定了微藻油脂的脂肪酸組成及DHA含量，并與其他工藝進(jìn)行對(duì)比分析，綜合評(píng)估了新工藝的特點(diǎn)及可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

裂殖壺藻(Schizochytriumsp.)：菌種由浙江師范大學(xué)菌種保藏中心保藏，經(jīng)谷氨酸鈉固體培養(yǎng)基活化，30 ℃搖瓶培養(yǎng)2～3 d，轉(zhuǎn)接至5 L種子罐進(jìn)行擴(kuò)培，最后轉(zhuǎn)接至50 L機(jī)械罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量10%，培養(yǎng)溫度28 ℃，自動(dòng)控制pH 6.5，通氣量為2 vvm，發(fā)酵時(shí)間約為4～5 d，發(fā)酵終止時(shí)殘?zhí)菨舛冉抵良s5 g/L。發(fā)酵液在4 ℃，8 000 r/min的條件下，離心15 min，收集微藻細(xì)胞，經(jīng)冷凍干燥后，研磨成粉。

1.2 儀器與試劑

FMG-5L和FUS-50L(A)機(jī)械發(fā)酵罐；HELIX超臨界天然產(chǎn)物萃取系統(tǒng)；K-501雙活塞往復(fù)泵；GC 7890A氣相色譜儀；BSA224S電子天平。

CO2氣體(純度≥99.9%)；甲苯、甲醇為色譜純；脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品、正己烷、乙醇等均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微藻油脂提取方法

有機(jī)溶劑提?。悍Q(chēng)取20.0 g微藻干粉，以正己烷為溶劑，采用索氏提取法，在80 ℃下抽提3 h。提取結(jié)束后，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷，稱(chēng)重，試驗(yàn)重復(fù)3次。一般而言，有機(jī)溶劑提取可視為微藻油脂的完全提取方法，為便于比較工藝，本研究定義了油脂回收率，即各工藝提取得到的油脂質(zhì)量占有機(jī)溶劑提取得到的總油脂質(zhì)量的百分比。

超臨界CO2夾帶乙醇提取：稱(chēng)取20.0 g微藻干粉，與等體積玻璃珠混合，置于萃取釜，分別設(shè)置萃取釜和分離釜的溫度和壓力，由雙活塞往復(fù)泵精準(zhǔn)控制夾帶劑乙醇的流速。提取過(guò)程中，每隔30 min取樣，稱(chēng)重并計(jì)算油脂回收率。CO2流速保持在5 L/min，純超臨界CO2提取采用以上相同的裝置。

1.3.2 夾帶劑乙醇加入量的確定

圖1 CO2-乙醇?xì)庖合嗥胶鈭D(323 K)

根據(jù)文獻(xiàn)查閱得到的熱力學(xué)數(shù)據(jù)[13，14]，繪制了323 K下CO2-乙醇?xì)庖合嗥胶鈭D，如圖1所示。在此溫度下，超臨界CO2夾帶乙醇的操作壓力應(yīng)大于臨界壓力(Pc，9.05 MPa)，而對(duì)應(yīng)的二氧化碳摩爾比應(yīng)大于其臨界摩爾比(xc，0.93 mol/mol)，由此可確定夾帶劑乙醇的摩爾比應(yīng)控制在0～0.07的范圍內(nèi)。以此類(lèi)推，進(jìn)一步查閱了313～333 K下的氣液相平衡數(shù)據(jù)，最終確定實(shí)驗(yàn)中乙醇摩爾比參考范圍為0～0.09。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)油脂提取過(guò)程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定優(yōu)化試驗(yàn)所需的提取時(shí)間，采用Design Expert 8.0軟件，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)(CCD)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的因素及水平

1.3.4 微藻油脂肪酸組成及含量測(cè)定

甲酯化：采用Cavonius等[15]的方法，略加修改。稱(chēng)取100 mg樣品，溶于2.5 mL甲苯，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的乙酰氯甲醇溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，80 ℃反應(yīng)2 h。冷卻后，加入4.5 mL 6%碳酸鈉溶液。5 000 r/min離心5 min，取有機(jī)相，進(jìn)行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：毛細(xì)管分析柱為Agilent HP-5,30 m×0.32 mm×0.25 μm；載氣為高純氮?dú)?純度>99.99%)，流速為30 mL/min；進(jìn)樣口、檢測(cè)器溫度分別為270、280 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流比100 ∶1。采用程序升溫：初始溫度為100 ℃，保持13 min，然后以10 ℃/min升溫至180 ℃，保持 6 min，再以1 ℃/min升溫至200 ℃，保持20 min，最后以4 ℃/min升溫至230 ℃，保持10.5 min。根據(jù)脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品確定樣品中的脂肪酸種類(lèi)，采用面積歸一法計(jì)算脂肪酸相對(duì)含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次[16]。

1.4 超臨界CO2夾帶乙醇流體密度估算

超臨界CO2夾帶乙醇流體的密度可用Peng-Robinson方程計(jì)算[17，18]。

(1)

(2)

式中：P為壓力/Pa；R為理想氣體常數(shù)/8.314 J/(mol·K)；T為溫度/K；Vm為摩爾體積/m3/mol；a為分子間引力，是關(guān)于溫度的函數(shù)；b為氣體總體積中包含分子本身體積的部分，是與臨界溫度和臨界壓力相關(guān)的常數(shù)。ρ為流體密度/kg/m3；xCO2、xEtOH分別為CO2、乙醇的摩爾比；MCO2、MEtOH分別為CO2、乙醇的相對(duì)分子質(zhì)量/g/mol。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取過(guò)程的動(dòng)力學(xué)分析

在優(yōu)化試驗(yàn)前，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取了溫度(40～60 ℃)、壓力(25～45 MPa)、乙醇摩爾比(0～0.09)的邊界值作為操作條件，分別繪制了超臨界CO2夾帶乙醇萃取裂殖壺藻油脂的提取過(guò)程曲線，如圖2所示。超臨界CO2夾帶乙醇流體提微藻油脂的動(dòng)態(tài)過(guò)程大致分為以下3個(gè)階段[19]：1)恒定提取速率期(Constant-extraction rate period, CER)，油脂回收率以相對(duì)恒定的速率快速增加；2)減速提取期(Falling-extraction rate period, FER)，油脂提取速率減慢，但回收率仍在明顯增加；3)擴(kuò)散控制提取期(Diffusion-controlled rate period, DCR)，油脂回收率以極緩慢的速率增加。盡管不同操作條件下，微藻油脂的提取速率各不相同，但提取3 h后均能進(jìn)入擴(kuò)散控制期，即可達(dá)到操作條件下最大油脂回收率。后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)的提取時(shí)間設(shè)定為3 h，事實(shí)上由于每批次提取試驗(yàn)CO2的流速是恒定的(即乙醇摩爾比僅取決于乙醇泵入的流速)，因此也意味著每批次試驗(yàn)的CO2用量恒定。

圖2 超臨界CO2夾帶乙醇萃取裂殖壺藻油脂的提取過(guò)程曲線

2.2 中心組合試驗(yàn)結(jié)果及響應(yīng)面模型

基于中心組合設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行了響應(yīng)面試驗(yàn)，并在各操作條件下計(jì)算了流體的密度，響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)試驗(yàn)值進(jìn)行了多元線性回歸分析，擬合得到了二階多項(xiàng)式方程如下：

表2 響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 超臨界CO2夾帶乙醇萃取裂殖壺藻油脂的方差分析

2.3 操作壓力及溫度對(duì)微藻油脂提取的影響

溫度和壓力對(duì)裂殖壺藻油脂回收率的影響如圖3所示。在乙醇摩爾比為0.04的條件下，考察了溫度和壓力對(duì)超臨界CO2夾帶乙醇萃取裂殖壺藻油脂的影響。圖3a表明溫度為50 ℃時(shí)，隨著壓力增加，油脂回收率先增大后減小，當(dāng)壓力約為38 MPa時(shí)，油脂回收率達(dá)到最大值85.5%。圖3b表明當(dāng)壓力從25 MPa增大至38 MPa時(shí)，流體密度從846 kg/m3逐漸增大至935 kg/m3，溶劑化效應(yīng)增強(qiáng)，有利于油脂溶解度的增加[20]，但壓力達(dá)到38 MPa后繼續(xù)增加，油脂回收率反而減少，原因可能是過(guò)高的壓力降低了物料的孔隙率，使流體難以擴(kuò)散進(jìn)入物料的孔狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部，增加了傳質(zhì)的阻力[21]。此外，在相同操作壓力35 MPa下，升高提取溫度也可以引起油脂回收率先增大后減小，如圖3a所示。溫度的升高一方面可以增大溶質(zhì)的蒸氣壓，增加微藻油脂的溶解度；另一方面也會(huì)降低流體密度，使溶劑化效應(yīng)減弱，阻礙油脂的提取[22]。兩方面效應(yīng)存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，在40～52 ℃范圍內(nèi)，蒸氣壓效應(yīng)占主導(dǎo)地位，油脂回收率從54.3%增大至最大值84.9%；在52～60 ℃范圍內(nèi)，則受溶劑化效應(yīng)控制，油脂回收率從最大值降至69.0%。

圖3 溫度和壓力對(duì)裂殖壺藻油脂回收率的影響

2.4 夾帶劑對(duì)微藻油脂得率的影響

乙醇摩爾比和壓力對(duì)裂殖壺藻油脂回收率的影響如圖4所示。夾帶劑在超臨界CO2流體萃取中作用機(jī)制尚存在很多爭(zhēng)議，最新基于統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)理論的研究[23]認(rèn)為夾帶劑與溶質(zhì)之間的相互作用對(duì)溶解度的增加起主導(dǎo)作用，而其他效應(yīng)如壓力變化引起的流體密度的增加、CO2及夾帶劑分子的簇集作用所引起的溶劑化效應(yīng)，可忽略不計(jì)。圖5a和圖5b分別顯示了在超臨界CO2夾帶乙醇流體的操作區(qū)域內(nèi)油脂回收率關(guān)于乙醇摩爾比、壓力的響應(yīng)面圖及等高線圖。由圖可知，當(dāng)壓力為35 MPa時(shí)，乙醇摩爾比由0增至0.04時(shí)，油脂回收率從71.6%增大到最大值84.3%，上升階段夾帶劑對(duì)油脂的增溶作用明顯；然而，當(dāng)流體中乙醇的摩爾比繼續(xù)增大，則會(huì)導(dǎo)致流體總體極性過(guò)高，偏離了甘油三酯等中性油脂的極性范圍，油脂回收率反而降低，在乙醇摩爾比為0.09的條件下，油脂回收率僅為68.6%。

圖4 乙醇摩爾比和壓力對(duì)裂殖壺藻油脂回收率的影響

2.5 優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證試驗(yàn)

回歸模型的分析結(jié)果顯示，超臨界CO2夾帶乙醇流體提取微藻油脂的最佳條件為：溫度51.51 ℃、壓力37.64 MPa、乙醇摩爾比0.04，在此條件下，微藻油脂回收率的預(yù)測(cè)值為86.0%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，驗(yàn)證試驗(yàn)所采用的工藝條件為：溫度52 ℃、壓力38 MPa、乙醇摩爾比0.04，3組平行試驗(yàn)的平均回收率為(88.2±0.5)%，與預(yù)測(cè)值基本相符，證明了在操作范圍內(nèi)模型擬合程度良好。傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法可從20 g微藻中提取到4.98 g油脂，環(huán)境友好型的超臨界CO2夾帶乙醇流體萃取的油脂回收率接近90%，顯著高于相同溫度、壓力條件下純超臨界CO2提取的油脂回收率(71.9%)，表明了夾帶劑乙醇加入后，超臨界CO2流體對(duì)裂殖壺藻油脂具有明顯的增溶作用。

2.6 不同工藝條件下脂肪酸組成的對(duì)比分析

不同工藝條件下裂殖壺藻油脂的脂肪酸組成見(jiàn)表4，表中顯示了新工藝得到的微藻油脂的脂肪酸組成，并與純超臨界CO2流體及傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取工藝進(jìn)行了對(duì)比研究。從脂肪酸組成分析結(jié)果來(lái)看，超臨界CO2夾帶乙醇流體提取得到的微藻油脂，完全可以達(dá)到傳統(tǒng)提取工藝的產(chǎn)品要求。作為DHA的生產(chǎn)原料，新工藝得到的裂殖壺藻油脂的DHA質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為39.9%，高于純超臨界CO2流體及正己烷提取得到的油脂中的含量，這可能是因?yàn)閵A帶劑乙醇的加入，一定程度上增大了流體的極性，從而更易提取得到DHA含量更高的極性磷脂[9]。超臨界CO2夾帶乙醇流體提取到的裂殖壺藻油脂中，總不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)50%，相應(yīng)的飽和脂肪酸比例略低于傳統(tǒng)工藝，屬于高品質(zhì)的微生物油脂，主要可用于DHA的生產(chǎn)，以軟脂酸為主的副產(chǎn)物亦可用于其他油脂產(chǎn)品的生產(chǎn)。

表4 不同工藝條件下裂殖壺藻油脂的脂肪酸組成

3 結(jié)論

本研究采用超臨界CO2夾帶乙醇流體，從裂殖壺藻中提取油脂，通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)構(gòu)建了響應(yīng)面方程，經(jīng)優(yōu)化得到了最佳工藝條件：溫度52 ℃，壓力38 MPa，乙醇摩爾比0.04；在此條件下，微藻油脂回收率為88.2%，顯著高于純超臨界CO2萃取的回收率(71.9%)。結(jié)合構(gòu)建的模型方程，以及通過(guò)Peng-Robinson方程計(jì)算得到的混合流體密度，部分解釋了溫度、壓力、乙醇摩爾比對(duì)油脂回收率的影響。夾帶劑乙醇的加入可將超臨界流體的極性范圍從低極性調(diào)整至中等極性，有利于富含DHA的中性微藻油脂的提取。氣相色譜對(duì)微藻油脂的化學(xué)組成分析結(jié)果表明，使用乙醇夾帶劑后，油脂中的DHA含量高于傳統(tǒng)工藝。由此可見(jiàn)，超臨界CO2夾帶乙醇流體萃取作為一種新型的、環(huán)境友好的綠色工藝，非常適用于富含多不飽和脂肪酸微藻油脂的提取，具有良好的應(yīng)用前景。