王春曉，邱成志，洪鐘時(shí)

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科，福建 泉州 362000

中國(guó)結(jié)直腸癌每年新發(fā)病例約37.5萬(wàn)，每年死亡病例約19.1萬(wàn)［1］，其死亡率的變化趨勢(shì)有性別及年齡差異，男性居民呈上升趨勢(shì)，女性居民呈小幅度下降趨勢(shì)；高年齡組居民死亡率呈上升趨勢(shì)［2］。由于結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿的特點(diǎn)再加上健康體檢的不到位，60%～70%的患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期［3］，因此，輔助化學(xué)治療仍是結(jié)直腸癌重要的治療措施。以鉑類和氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的FOLFOX方案是目前結(jié)直腸癌的一線用藥。但化療過(guò)程中易產(chǎn)生化療耐藥，因此，研究結(jié)直腸癌的化療耐藥相關(guān)機(jī)制并逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥至關(guān)重要。

近年來(lái)研究表明，高爾基磷酸化蛋白3（Golgi phosphoprotein 3，GOLPH3）基因可促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖并抑制凋亡，是一種新的原癌基因［4-5］，本實(shí)驗(yàn)采用siRNA干擾技術(shù)，探討沉默GOLPH3基因逆轉(zhuǎn)HT29結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞株

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，TRIzol、SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自立陶宛Fermentus公司，SYBR Ex Taq試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，siRNA靶向GOLPH3（GCUUGCUUAAUCATGGTTAT）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Opti-MEM購(gòu)自上海拓然生物科技有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海偉進(jìn)生物科技有限公司，兔抗人GOLPH3多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（ab98023），兔抗人P-gp單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（ab170904)），ERK1/2購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（ab17942），pERK1/2購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（ab201015），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)有限公司（A0208），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物根據(jù)基因全序列設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程有限公司合成，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinases，ERK）1/2抑制劑PD98059購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司（9900S），順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司，GOLPH3購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640+10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、95%飽和濕度環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組

將結(jié)腸癌細(xì)胞分為5組。①對(duì)照組：HT29細(xì)胞；②轉(zhuǎn)染組：用siRNA-GOLPH3轉(zhuǎn)染的HT29細(xì)胞組（采用脂質(zhì)體法，參照說(shuō)明書用50 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞）；③實(shí)驗(yàn)組1：順鉑處理后的HT29細(xì)胞組；④實(shí)驗(yàn)組2：順鉑處理后的siRNA-GOLPH3轉(zhuǎn)染細(xì)胞組；⑤實(shí)驗(yàn)組3：順鉑和ERK1/2抑制劑PD98059（濃度為50 μmol/L）處理后的HT29細(xì)胞組。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均在含10 μmol/L順鉑的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24 h。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29轉(zhuǎn)染前后GOLPH3 mRNA的表達(dá)

用RT FQ-PCR檢測(cè)對(duì)照組及轉(zhuǎn)染組的GOLPH3 mRNA的表達(dá)。用TRIzol裂解法提取結(jié)腸癌細(xì)胞株總RNA，溶于適量RNase-free的超純水中，用分光光度計(jì)檢測(cè)R NA濃度。將R N A 反轉(zhuǎn)錄為c DNA，以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行RT FQ-PCR。G OL PH 3上游引物：5'-AGGGCGACTCCA AGGA A A-3'，下游引物：5'-TGATGTGTAACCCTCGCG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度：83bp；18 Sr RNA 上游引物：5'-GGTCATAAGCTTGCGTTGATTAAG-3'，下游引物：5'-CTACGGAAACCTTGTTAC GACTTT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度：189 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共循環(huán)45次，在退火階段檢測(cè)熒光；融解曲線條件為50 ℃ 15 s，51 ℃升溫至99 ℃，每升高1 ℃停留5 s；數(shù)據(jù)分析通過(guò)相對(duì)定量-ΔΔCT法進(jìn)行。

1.2.4 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖

各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種于96孔板上，每孔加100 μL（1×105個(gè)細(xì)胞），貼壁培養(yǎng)24 h后每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔及對(duì)照孔，對(duì)照孔僅加入細(xì)胞不做處理。培養(yǎng)48 h后，每孔加5 mg/mL的MTT 10 μL培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液。每孔加二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，避光振蕩混勻，結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的吸光度（D）值，以上步驟重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力

①血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，6孔板的每個(gè)孔各接種不同處理類型的細(xì)胞1 000個(gè)；②每3 d換液1次，根據(jù)細(xì)胞種類不同，持續(xù)2周；③經(jīng)常觀察，待克隆長(zhǎng)到肉眼可見，終止培養(yǎng)，PBS清洗1次；④甲醇固定20 min，PBS洗2遍；⑤0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min；⑥PBS清洗3次，拍照計(jì)數(shù)；⑦以上步驟重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)各組細(xì)胞株GOLPH3、P-gp、ERK1/2、pERK1/2等蛋白質(zhì)的水平

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，用PBS清洗1次，再將細(xì)胞溶解在RIPA裂解緩沖液中，在冰上作用20 min。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，分別利用細(xì)胞裂解液提取的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉60 min，分別加入一抗GOLPH3、P-gp、ERK1/2、pERK1/2，4 ℃溫育過(guò)夜；PBST漂洗20 min×3次；加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液，室溫溫育1 h；PBST漂洗10 min×3次；ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)。圖像應(yīng)用Image-J軟件進(jìn)行灰度分析，目的蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度=目的條帶的灰度值/GAPDH條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HT29結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

2.1.1 siRNA-GOLPH3有效沉默人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中GOLPH3基因的表達(dá)

對(duì)照組HT29細(xì)胞GOLPH3 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.002±0.223，而轉(zhuǎn)染組的GOLPH3 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.162±0.062，轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組中的GOLPH3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.003±0.094和0.099±0.112，轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖1）。

圖1 對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組中的GOLPH3 mRNA表達(dá)和蛋白水平Fig.1 The expression levels of GOLPH3 mRNA and protein in the control and transfection groups

2.1.2 HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-GOLPH3后增殖及克隆形成能力均顯著降低

MTT法檢測(cè)HT29細(xì)胞增殖顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的D490值為0.715±0.074，對(duì)照組D490值為1.007±0.130，轉(zhuǎn)染組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的集落數(shù)為341.700±54.930，對(duì)照組的細(xì)胞集落數(shù)為463.300±43.020，轉(zhuǎn)染組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞增殖與克隆形成能力Fig.2 The proliferation and colony formation capability of cancer cells in the transfection group and the control group

2.2 沉默GOLPH3基因表達(dá)可提高順鉑抑制HT29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與克隆形成能力

MTT法檢測(cè)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2中細(xì)胞的D490值分別為1.000±0.127、0.746±0.085和0.236±0.071，實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的D490值均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001），同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組2的D490值顯著低于實(shí)驗(yàn)組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2細(xì)胞的集落數(shù)分別為604.700±39.700、442.300±34.270和126.300±45.650，實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的細(xì)胞集落數(shù)均顯著低于對(duì)照組的細(xì)胞集落數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001），同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組2的細(xì)胞集落數(shù)顯著低于實(shí)驗(yàn)組1的細(xì)胞集落數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3）。

2.3 沉默GOLPH3基因表達(dá)逆轉(zhuǎn)HT29細(xì)胞對(duì)順鉑化療耐藥的機(jī)制

2.3.1 沉默GOLPH3基因表達(dá)可下調(diào)pERK1/2的表達(dá)而抑制絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）信號(hào)通路

在順鉑處理下，實(shí)驗(yàn)組2的GOLPH3、P-gp的蛋白表達(dá)量分別為0.249±0.084、1.842±0.383，而實(shí)驗(yàn)組1的GOLPH3、P-gp的蛋白表達(dá)量分別為2.734±0.440、4.269±0.454，實(shí)驗(yàn)組2的GOLPH3、P-gp的蛋白表達(dá)量較實(shí)驗(yàn)組1均同步顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同時(shí)，ERK1/2蛋白在實(shí)驗(yàn)組1、2及對(duì)照組均無(wú)顯著差異，而實(shí)驗(yàn)組2的pERK1/2表達(dá)量為1.124±0.410，顯著低于實(shí)驗(yàn)組1的4.353±0.956，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖4，表1）。

2.3.2 阻斷MAPK/ERK信號(hào)通路后可逆轉(zhuǎn)HT29結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，順鉑處理并采用MAPK/ERK信號(hào)通路阻滯劑（PD98059），實(shí)驗(yàn)組3中P-gp的蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.525±0.189，比實(shí)驗(yàn)組1的3.430±0.335顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖5）。

圖3 實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2及對(duì)照組癌細(xì)胞增殖與克隆形成能力Fig.3 The proliferation and colony formation capability of cancer cells in experimental group 1,experimental group 2 and the control group

圖4 順鉑處理下對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression levels of the related proteins in the control group,experimental group 1 and experimental group 2 with cisplatin treatment

表1 對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2中相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量Tab.1 The relative expression levels of related proteins in the control group,experimental group 1 and experimental group 2

圖5 順鉑處理下對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組3中P-gp蛋白表達(dá)Fig.5 Expression level of P-gp protein in the control group,experimental group 1 and experimental group 3 with cisplatin treatment

3 討 論

順鉑作為鉑類化療藥物的代表，癌細(xì)胞對(duì)其耐藥仍是臨床難題，其機(jī)制包括多方面［6］，如基因表達(dá)異常等。GOLPH3基因是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的癌基因，定位于5p13上，編碼高爾基體復(fù)合物的一種約34×103的相關(guān)蛋白質(zhì)。研究表明，人結(jié)直腸癌組織中GOLPH3蛋白存在過(guò)表達(dá)，與細(xì)胞分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期晚、增殖等呈正相關(guān)，與凋亡呈負(fù)相關(guān)，與結(jié)直腸癌組織血管生成有關(guān)，可激活Wnt細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［7-10］。因此本研究旨在探討GOLPH3基因表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。

本研究顯示，在順鉑處理下，HT29結(jié)腸癌細(xì)胞沉默GOLPH3基因表達(dá)后，其癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力明顯抑制，說(shuō)明GOLPH3基因參與HT29細(xì)胞的化療耐藥，表明下調(diào)GOLPH3基因表達(dá)可提高HT29結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。這可能與GOLPH3基因高表達(dá)可激活PI3K/AKT/mTOR和Wnt/β-catenin細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路有關(guān)，這些信號(hào)通路下游靶基因如MDR1、MRP1、c-myc等可參與癌細(xì)胞對(duì)鉑類化療藥物耐藥［11-14］。同時(shí)有研究證實(shí)，非小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑耐藥與PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異?；罨嘘P(guān)［15］。GOLPH3基因高表達(dá)是否存在激活其他細(xì)胞信號(hào)通路如MAPK/ERK參與順鉑化療的耐藥，有待進(jìn)一步研究。

已有研究報(bào)道，MAPK/ERK1/2信號(hào)通路過(guò)度激活與許多腫瘤對(duì)鉑類耐藥性的產(chǎn)生存在明顯的相關(guān)性，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控耐藥相關(guān)基因和蛋白如P-gp的表達(dá)［16］。P-gp是由多藥耐藥基因編碼的一種跨膜糖蛋白，是細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的分子基礎(chǔ)［17］。李敏等［18］的研究表明，白頭翁皂苷B4能逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞（LoVo/L-OHP）對(duì)奧沙利鉑的耐藥，其機(jī)制可能與降低P-gp表達(dá)有關(guān)。

本研究證實(shí)，在順鉑處理下，下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞GOLPH3表達(dá)，P-gp、pERK1/2蛋白表達(dá)量同步明顯下降，而阻滯MAPK/ERK信號(hào)通路活性，可顯著降低HT29細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)，表明GOLPH3基因高表達(dá)促進(jìn)HT29細(xì)胞對(duì)順鉑的化療耐藥與激活MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)，沉默GOLPH3基因表達(dá)能在一定程度上逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。這主要是GOLPH3基因能引起ERK1/2磷酸化，上調(diào)P-gp的表達(dá)而產(chǎn)生耐藥性。

綜上所述，沉默GOLPH3基因的表達(dá)可在一定程度上通過(guò)抑制MAPK/ERK信號(hào)通路活性逆轉(zhuǎn)HT29結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療耐藥。