李喜香 豆金彥 潘從澤 陳二林

摘要：目的 ?觀察補(bǔ)腦軟膠囊對β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）所致阿爾茨海默?。ˋD）大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響，探討其治療AD的可能機(jī)制。方法 ?將90只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組和補(bǔ)腦軟膠囊高、中、低劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃。除假手術(shù)組注射生理鹽水外，其余各組大鼠均在左側(cè)腦室海馬區(qū)注射聚集態(tài)Aβ1-42制作AD大鼠模型。灌胃給藥14 d后，采用Morris水迷宮實驗評價大鼠學(xué)習(xí)記憶能力;取大鼠海馬組織，HE染色，鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)情況;大鼠腦組織制備勻漿，測定過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量;免疫組化檢測大鼠海馬組織β-分泌酶活性。結(jié)果 ?與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，平臺象限穿越次數(shù)明顯減少（P<0.01）;腦組織CAT、GSH-Px、SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高（P<0.05，P<0.01），海馬β-分泌酶活性明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，平臺象限穿越次數(shù)明顯增加（P<0.05）;補(bǔ)腦軟膠囊高、中劑量組大鼠腦組織CAT、GSH-Px、SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低（P<0.01）;補(bǔ)腦軟膠囊各劑量組大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯修復(fù)，其中高、中劑量組海馬組織β-分泌酶活性明顯降低（P<0.01）。結(jié)論 ?補(bǔ)腦軟膠囊可明顯改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能是通過抗自由基損傷及降低海馬組織β-分泌酶活性來發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞損傷作用。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)腦軟膠囊;阿爾茨海默病;β-淀粉樣蛋白1-42;海馬神經(jīng)細(xì)胞;β-分泌酶;大鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）11-0057-05

Abstract： Objective To investigate the effects of Bunao Soft Capsules on learning and memory ability and hippocampal nerve cell injury of Alzheimer disease （AD） rats induced by intracerebroventricular injection of Aβ1-42; To discuss its possible mechanism for treatment of AD. Methods Totally 90 male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group， model group， positive control group， and Bunao Soft Capsules high-， medium-， and low-dosage groups. Each administration was given relevant medicine for gavage. Except for sham-operation group， all the other rats were injected with aggregated Aβ1-42 into the left hippocampus to make AD rat models. After 14 days of gavage administration， the learning and memory ability of rats was evaluated by Morris water maze test; Rat hippocampus tissue was taken and stained with HE， and the repair of nerve cell injury was observed under microscope; Preparation of homogenate in rat brain tissue was used to determine the activity of CAT， GSH-Px， SOD and MDA content; Immunohistochemistry was used to detect β-secretase activity in rat hippocampus. Results Compared with the sham-operation group， the escape latent period of model group was significantly prolonged （P<0.01）; the times of crossing target quadrant significantly decreased （P<0.01）; the activity of CAT， GSH-Px and SOD in brain tissue decreased; the level of MDA increased significantly （P<0.05， P<0.01）; the activity of β-secretion in the hippocampus increased significantly （P<0.05）. Compared with the model group， the escape latency period of BunaoSoft Capsules high-dosage group was significantly shortened and the times of crossing target quadrant significantly increased （P<0.05）. The activity of CAT， GSH-Px and SOD in Bunao Soft Capsules high- and medium-dosage groups significantly increase （P<0.01）， and the level of MDA significantly decreased. Rat nerve cell injury repair effect was obvious， and hippocampal tissue β-secretase activity was significantly reduced in Bunao Soft Capsules groups （P<0.01）. Conclusion Bunao Soft Capsules can improve learning and memory ability of AD rats and its mechanism may be to exert anti-neuronal damage by anti-free radical damage and reduce β-secretase activity.

Keywords： Bunao Soft Capsules; Alzheimer disease; β-amyloid; hippocampal nerve cell; β-secretase; rats

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要以進(jìn)行性記憶功能障礙、認(rèn)知障礙、行為異常、社交障礙等為特征，然而迄今其病因尚不明確。其中，β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）在大腦皮層及海馬區(qū)聚集并形成老年斑是該病的一大特征[1-2]。補(bǔ)腦軟膠囊前身補(bǔ)腦膏是我院夏永潮主任醫(yī)師創(chuàng)建的“中醫(yī)佛手治療體系”中的方劑之一，在甘肅省中醫(yī)院腦病科近30年的臨床應(yīng)用及動物實驗中表明，其對治療腦外傷性神經(jīng)損傷及后遺癥，腦炎、腦膜炎后遺癥，腦、脊髓變性等腦部疾病療效確切[3-4]。在長期臨床應(yīng)用中，補(bǔ)腦膏在劑型方面不能完全滿足臨床用藥的需求。本實驗采用新設(shè)備結(jié)合新輔料和新工藝，將傳統(tǒng)煎膏劑制成補(bǔ)腦軟膠囊[5-6]，通過大鼠顱內(nèi)注射Aβ1-42建立老年斑塊化AD模型，觀察補(bǔ)腦軟膠囊對AD大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞的影響，探討其治療AD的可能機(jī)制，為補(bǔ)腦軟膠囊在治療AD方面的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 ?實驗材料

1.1 ?藥物

補(bǔ)腦軟膠囊（當(dāng)歸、川芎、黃芪、赤芍等，1 g相當(dāng)于原藥材23.6 g），甘肅省中醫(yī)院科研制劑中心配制，批號20180601;鹽酸多奈哌齊片，5 mg/片，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號1702012。

1.2 ?動物

SPF級雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量（260±20）g，中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四零醫(yī)院動物實驗中心提供，動物許可證號SYXK（甘）2012-0029。飼養(yǎng)于溫度18～22 ℃、相對濕度40%～60%環(huán)境，正常光照，自由攝食飲水。

1.3 ?主要試劑與儀器

Aβ1-42 淀粉樣蛋白，美國Anaspec公司，批號1855817;過氧化氫酶（CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號分別為20181101、20180912、20181012、20181201;4%多聚甲醛組織固定液，武漢博士德生物工程有限公司，批號1901022;免疫組化試劑盒DAB顯色劑，DAKO公司，批號K5007;水合氯醛，阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號B1826028;二甲苯，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號10023418;無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號100092683;蘇木素染液套裝，武漢谷歌生物科技有限公司，批號G1005;滅菌注射用水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號M17010224。PUMP 11 ELITE Nanomite腦立體定位儀專用注射泵，美國Harvard Apparatus公司;51500D大小鼠腦立體定位儀，美國哈佛儀器公司;JJ-12J脫水機(jī)，武漢俊杰電子有限公司;JB-P5包埋機(jī)，武漢俊杰電子有限公司;JB-L5凍臺，武漢俊杰電子有限公司;KD-P組織攤片機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司。

2 ?實驗方法

2.1 ?造模

參照文獻(xiàn)[7-10]方法制作AD模型。將0.5 mg Aβ1-42冷凍干粉溶于40 μL 1%NH4OH溶液中，加入460 μL PBS，制得濃度為1 μL/μg貯備液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1周，成為聚集態(tài)，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，用腦立體定位儀平顱固定，切開，暴露顱囪，取前囪后3.5 mm，中縫左側(cè)旁開2.0 mm，用牙科鉆手動鉆開顱骨，暴露硬腦膜，微量進(jìn)樣器自腦表面垂直進(jìn)入2.8 mm，5 min內(nèi)將Aβ1-42肽段10 μL（10 μg）緩慢注入，留針5 min保證溶液充分彌散。另15只假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)注射生理鹽水，然后3 min內(nèi)緩慢撤針，縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)后每只大鼠腹腔注射青霉素鈉（20 U/d），連續(xù)3 d。

2.2 ?分組

90只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組和補(bǔ)腦軟膠囊高、中、低劑量組，每組15只。

2.3 ?給藥

各組實驗大鼠均于術(shù)后第1日開始給藥，實驗藥物用滅菌注射用水配制為混懸液。陽性對照組給予鹽酸多奈哌齊（3 mg/kg）藥液灌胃，補(bǔ)腦軟膠囊高、中、低劑量組分別給予800、400、200 mg/kg藥液灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)14 d。

2.4 ?指標(biāo)測定

2.4.1 ?Morris水迷宮實驗

實驗大鼠給藥14 d后進(jìn)行Morris水迷宮實驗評價大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。水迷宮裝置由圓形水池、可移動平臺和自動錄像分析系統(tǒng)組成。水池直徑100 cm，水深25 cm，水溫控制在22～25 ℃。定位航行實驗：將受試大鼠按順時針方向依次由第1、2、3、4象限入水點順序放入水中，記錄2 min內(nèi)尋找平臺時間（逃避潛伏期）和總路程?？臻g探索實驗：定位航行實驗結(jié)束后，次日進(jìn)行空間探索試驗，撤去平臺后選第1象限同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，測其2 min內(nèi)跨越原平臺位置次數(shù)和大鼠在平臺象限停留時間、距離，判斷大鼠記憶儲存及提取再現(xiàn)能力。

2.4.2 ?生化指標(biāo)

末次給藥12 h后禁食不禁水，次日大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，冰生理鹽水心臟灌注，直至流出液體基本無色，停止灌注。取腦組織，分離海馬組織，腦組織加1 mL生理鹽水，勻漿機(jī)中制備成10%腦勻漿，低溫3000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明分別測定CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA含量，采用BCA法測定蛋白含量。

2.4.3 ?HE染色觀察神經(jīng)細(xì)胞損傷

分離出的海馬組織4%多聚甲醛固定，再經(jīng)洗滌脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片、二甲苯脫蠟及水化、HE染色、封片等，鏡下觀察海馬組織變化。每個標(biāo)本連續(xù)切片5張，厚度4 μm。正常海馬組織形態(tài)為CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，層次分明;胞質(zhì)均質(zhì)染色，核大而圓，胞核無固縮;纖維結(jié)構(gòu)清晰，未見淋巴細(xì)胞浸潤。

2.4.4 ?免疫組化檢測β-分泌酶活性

石蠟切片脫蠟至水后，抗原修復(fù)，加一抗、二抗孵育，DAB顯色，Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水封閉后鏡檢，圖像采集分析。其中，深棕色為強(qiáng)陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍(lán)色細(xì)胞核為陰性。進(jìn)而對每個組織切片進(jìn)行識別，分析出強(qiáng)陽性、中度陽性、弱陽性及陰性面積，陽性百分比，最后進(jìn)行組織化學(xué)評分。

3 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 ?結(jié)果

4.1 ?補(bǔ)腦軟膠囊對模型大鼠Morris水迷宮實驗學(xué)習(xí)記憶能力的影響

定位航行實驗：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠運動軌跡相對混亂，逃避潛伏期明顯延長（P<0.01）;與模型組比較，補(bǔ)腦軟膠囊各劑量組和陽性對照組大鼠運動軌跡相對平緩，逃避潛伏期縮短，補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組和陽性對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），見表1。空間探索實驗：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠平臺象限穿越次數(shù)明顯減少（P<0.01）;與模型組比較，補(bǔ)腦軟膠囊各劑量組和陽性對照組平臺象限穿越次數(shù)增加，補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

4.2 ?補(bǔ)腦軟膠囊對模型大鼠腦組織過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織CAT、GSH-Px、SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，補(bǔ)腦軟膠囊高、中劑量組大鼠腦組織CAT、GSH-Px、SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），補(bǔ)腦軟膠囊低劑量組大鼠腦組織GSH-Px活性明顯升高（P<0.05）。結(jié)果見表3。

4.3 ?補(bǔ)腦軟膠囊對模型大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。假手術(shù)組大鼠海馬組織神經(jīng)元數(shù)量豐富、排列規(guī)則、形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胞核、胞質(zhì)分界明顯，核仁清晰，未見明顯炎癥，鏡下可見CA1區(qū)錐體細(xì)胞分4層排列，整齊規(guī)則，胞漿尼氏體著色清晰，胞核淡染，核仁清楚;模型組大鼠海馬齒狀回區(qū)可見少量神經(jīng)元皺縮，染色加深，胞核、胞質(zhì)分界不清（黃色箭頭），較多神經(jīng)元胞質(zhì)空泡化（紅色箭頭），多見毛細(xì)血管輕度瘀血，CA4區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，可見少量神經(jīng)元皺縮，染色加深（綠色箭頭）;陽性對照組胞核、胞質(zhì)分界明顯，核仁清晰，齒狀回區(qū)可見較多神經(jīng)元皺縮，染色加深，胞核胞質(zhì)分界不清（黑色箭頭）;補(bǔ)腦軟膠囊高、中劑量組大鼠海馬齒狀回區(qū)可見神經(jīng)元胞核體積減小、染色加深，少量神經(jīng)元皺縮，胞核、胞質(zhì)分界不清（黃色箭頭）;補(bǔ)腦軟膠囊低劑量組大鼠海馬可見大量神經(jīng)元變性，胞質(zhì)疏松淡染（黑色箭頭），齒狀回區(qū)局部可見較多神經(jīng)元皺縮，染色加深，較多神經(jīng)元胞質(zhì)空泡化（紅色箭頭）。各給藥組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元胞漿染色清晰，胞核淡染，形態(tài)明顯好于模型組。但各給藥組間無明顯差異。結(jié)果見圖1。

4.4 ?補(bǔ)腦軟膠囊對大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞β-分泌酶活性的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞β-分泌酶活性明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，補(bǔ)腦軟膠囊高、中劑量組和陽性對照組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞β-分泌酶活性明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖2、表4。

5 ?討論

AD是一種病因復(fù)雜、隱匿，病程進(jìn)行性發(fā)展的中樞神經(jīng)退行性病變，隨著疾病的進(jìn)展，患者表現(xiàn)為認(rèn)知、記憶、定向等能力明顯下降，生活自理能力逐漸喪失。目前的研究將AD的發(fā)病原因主要集中在Aβ聚集形成淀粉樣斑塊、Tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)、Cav-1蛋白及EPh家族蛋白相關(guān)基因突變、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)、膽堿能損傷等。

大腦皮層和海馬區(qū)淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）主要受3種分泌酶（α、β、γ）的影響。α-分泌酶將APP分解為2段，β-、γ-分泌酶分別作用于蛋白質(zhì)N、C端，經(jīng)β-、γ-分泌酶作用，產(chǎn)生2種不同的肽，一種肽正常，另一種肽易聚集、毒性強(qiáng)，稱為Aβ淀粉樣肽[11]。正常情況細(xì)胞產(chǎn)生的Aβ幾乎無神經(jīng)毒性，異?；虿±頎顟B(tài)Aβ的產(chǎn)生和代謝不平衡可形成具有神經(jīng)血管毒性的纖維狀聚集物，進(jìn)一步形成老年斑，這被認(rèn)為是AD發(fā)生的早期觸發(fā)因素[13]。老年斑與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，引起神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能衰退，在這個過程中單獨發(fā)生或并發(fā)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性和死亡[12-13]。老年斑是AD的不變特征，且極有可能是直接病因。因此抑制β-分泌酶的表達(dá)，可能減少斑塊的形成。Aβ斑塊沉積，進(jìn)一步破壞神經(jīng)元細(xì)胞膜，細(xì)胞通透性隨之增加，大量Ca2+進(jìn)入細(xì)胞，依次激活鈣依賴性激酶、蛋白酶、脂肪酶、細(xì)胞內(nèi)自由基生成，導(dǎo)致細(xì)胞損傷乃至死亡。蛻變的神經(jīng)元釋放有毒物質(zhì)，轉(zhuǎn)而刺激其他細(xì)胞釋放炎癥因子，引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，同時產(chǎn)生自由基，而局部炎癥反應(yīng)又可加劇Aβ沉積，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腦軟膠囊可保護(hù)大鼠海馬組織，抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞中β-分泌酶的表達(dá)，起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。

機(jī)體遭受有害刺激時，體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)被激活，自由基產(chǎn)生隨之增加，過氧化物超負(fù)荷，機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)間穩(wěn)態(tài)被破壞，從而損傷體內(nèi)生物大分子物質(zhì)。Aβ沉積對氧自由基代謝系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)影響，過氧化物可使溶解狀態(tài)的Aβ轉(zhuǎn)化為聚集態(tài)的Aβ，從而加速老年斑的形成[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，補(bǔ)腦軟膠囊可提高大鼠腦內(nèi)過氧化物酶CAT、SOD和GSH-Px的活性，高劑量組作用更明顯。

AD屬中醫(yī)學(xué)“呆證”“文癡”“郁證”“善忘”等范疇，其病位在腦，與肝、脾、腎密切相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，對癡呆的治療，補(bǔ)腎益髓是基礎(chǔ)，活血化瘀、化痰通絡(luò)是增進(jìn)智能的關(guān)鍵[15]。補(bǔ)腦軟膠囊以甘肅道地藥材岷當(dāng)歸為君藥，養(yǎng)血、活血、祛瘀，加川芎、赤芍增強(qiáng)活血之力，配黃芪益氣，合黃精、淫羊藿、補(bǔ)骨脂健脾補(bǔ)腎、養(yǎng)血生津，益母草祛瘀生新，甘草調(diào)和諸藥，諸藥共奏養(yǎng)血活血、補(bǔ)益肝腎、化瘀通絡(luò)功效。本實驗結(jié)果顯示，補(bǔ)腦軟膠囊通過清除自由基、抗氧化作用，以及抑制神經(jīng)細(xì)胞β-分泌酶的表達(dá)，減少Aβ淀粉樣肽產(chǎn)生，最終阻滯AD的發(fā)生與發(fā)展。本研究為其臨床治療AD提供了依據(jù)，但AD發(fā)生與發(fā)展是多通道、多因素共同作用的結(jié)果，今后有待于對藥物作用機(jī)制進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-06-20）

（修回日期：2019-07-17;編輯：華強(qiáng)）