周廣帆，楊殿林，秦 潔，李青梅，趙建寧

（1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點實驗室 / 天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室，天津 300191；3. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

退耕還草是我國重大的生態(tài)建設(shè)工程。退耕還草后土壤團聚體穩(wěn)定性增加，土壤結(jié)構(gòu)改善[1]，土壤微生物和線蟲群落結(jié)構(gòu)改變[2-4]，土壤固碳效益提高[5]，土壤生態(tài)系統(tǒng)功能得以可持續(xù)發(fā)展[6]。

土壤微生物在物質(zhì)循環(huán)和能量流動過程中起重要作用，其群落結(jié)構(gòu)和多樣性與土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性關(guān)系密切[7-8]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在不同土地利用類型之間存在著明顯的差異[9]，植被類型影響微生物群落碳源利用能力[10]，種植豆科植物可以增加土壤微生物生物量[11]，退耕還草可以改變土壤微生物群落特征[12]。土壤線蟲常被用作指示土壤食物網(wǎng)狀況和土壤健康的后生動物[13-14]，不同的土地利用方式和植被類型改變土壤線蟲的群落結(jié)構(gòu)[15-18]。土壤微生物和土壤線蟲之間的相互作用構(gòu)成了土壤微食物網(wǎng)最重要的一部分，影響土壤有機質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)[19]，從而調(diào)節(jié)土壤生態(tài)系統(tǒng)功能[20]。

丹江口水源涵養(yǎng)區(qū)位于南北氣候分界的過渡地帶，是南水北調(diào)中線工程核心水源區(qū)、國家級生態(tài)示范區(qū)和鄂西北國家級重點生態(tài)功能保護區(qū)，也是國家集中連片特殊困難地區(qū)。丹江口水源涵養(yǎng)區(qū)生態(tài)環(huán)境脆弱，80%以上土地屬于土石山區(qū)和丘陵溝壑區(qū)。頻繁的人類活動造成了土地退化，退耕還草是其進行生態(tài)保護的重要舉措。目前針對丹江口水源涵養(yǎng)區(qū)的研究大多集中于水土流失，鮮有土壤生態(tài)效應(yīng)相關(guān)報道。為此，研究丹江口水源涵養(yǎng)區(qū)退耕還草土壤微生物和線蟲群落變化特征，探討土壤微生物和土壤線蟲群落相互作用機制，可為全面分析和評估水源涵養(yǎng)區(qū)退耕還草的土壤生態(tài)效應(yīng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為庫區(qū)生態(tài)環(huán)境保護和土地可持續(xù)利用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況及試驗設(shè)計

試驗區(qū)位于湖北省十堰市鄖陽區(qū)，隸屬秦巴山區(qū)，地處32°25′-33°16′ N，110°07′-111°16′ E，亞熱帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫15.4 ℃，年均降水量769.6 mm，無霜期244 ～ 255 d。在研究區(qū)內(nèi)選取3個具有代表性的退耕3年的紫花苜蓿(Medicago sativa，MS)草地作為退耕樣地，每塊退耕樣地均選取相鄰(＜ 10 m)長期種植玉米(Zea mays，ZM)的農(nóng)田作為對照，土壤類型為泥質(zhì)巖黃棕壤。樣地海拔高度、坡向坡位基本一致。紫花苜蓿地和玉米農(nóng)田均按常規(guī)管理：紫花苜蓿年刈割4次，玉米收獲后秸稈不還田，紫花苜蓿地施肥量為N 120 kg·hm-2，P2O575.0 kg·hm-2；玉米田施肥量為N 315 kg·hm-2，P2O5100 kg·hm-2。

1.2 土壤樣品采集

2017年9月，在每個取樣區(qū)各布設(shè)6個10 m ×10 m的樣方，按照“等量、多點、混合”的原則，每個樣方內(nèi)按“S”形選取10個采樣點，用內(nèi)徑為5 cm的土鉆，按0-10和10-20 cm分層取樣，四分法混勻后取1 kg左右的新鮮土樣放入無菌自封袋內(nèi)，及時放入4 ℃冰盒帶回，共72份土壤樣品。將土樣分成3份，一份于室內(nèi)自然風(fēng)干待測土壤理化，一份土樣保存于-70 ℃冰箱待測土壤微生物，一份新鮮土樣用于土壤線蟲的分離鑒定。

1.3 土壤微生物磷脂脂肪酸的測定分析

土壤微生物磷脂脂肪酸的提取與分析采用Bligh-Dyer法[21]：取保存于-70 ℃超低溫冰箱內(nèi)的土壤樣品在冷凍干燥機內(nèi)進行凍干處理；取3 g凍干土于特氟龍離心管，加單相提取劑(氯仿∶甲醇∶檸檬酸 = 1∶2∶0.8)水平震蕩離心提取總脂，加緩沖液過夜保存，提取下層氯仿相，氮氣吹干；經(jīng)氯仿活化的SPE柱收集磷脂，氮氣吹干；將所得磷脂加入甲醇甲苯混合液(1∶1)進行甲酯化，氮氣吹干，用正己烷溶解后保存于樣品瓶內(nèi)，然后采用HP6890氣相色譜-HP5973質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS)進行分析。測定時，以十九烷酸甲酯(19:00)作為內(nèi)標(biāo)，脂肪酸的定量方法采用峰面積和內(nèi)標(biāo)曲線法。然后根據(jù)不同微生物群落磷脂脂肪酸的分子結(jié)構(gòu)和基團位置，可將其分為放線菌、細菌、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌[22]。細菌總量以細菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌加和表示，土壤微生物PLFAs總量以檢測得到的特征脂肪酸加和表示(表1)。

1.4 土壤線蟲鑒定與群落分析

土壤線蟲分離采用淺盤法[23]：分離-過篩-沖洗后，加入固定液保存，在解剖鏡和體式顯微鏡下分別進行計數(shù)和鑒定。鑒定參照Bongers的分類圖[24]和尹文英[25]《中國土壤動物檢索圖鑒》利用形態(tài)學(xué)方法鑒定。土壤線蟲數(shù)量折算成每百克干土中含有的線蟲條數(shù)。在分析土壤線蟲群落時，可根據(jù)線蟲取食生境和線蟲形態(tài)學(xué)特征將土壤線蟲分為食細菌類群(bacterivores，Ba)、食真菌類群(fungivores，F(xiàn)u)、植物寄生類群(plant parasites，Pp)、捕/雜 食 類 群(predators/omnivores，Op)[26]，營養(yǎng)類群均按相對豐度計算。群落結(jié)構(gòu)指數(shù)使用通路 指 數(shù)(nematode channel ratio，NCR)、富 集 指 數(shù)(enrichment index，EI)、結(jié) 構(gòu) 指 數(shù)(structure index，SI)來表示[27]。

土壤理化采用實驗室常規(guī)方法測定[28]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

退耕樣地與未退耕樣地之間的土壤微生物群落顯著性差異(t檢驗，P ＜ 0.05)采用SPSS17.0分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，運用OriginPro 9.1軟件作圖；土壤微生物與土壤理化因子和土壤線蟲群落之間采用Pearson相關(guān)性分析；退耕還草微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)差異分析采用主成分分析，土壤理化因子、土壤微生物和土壤線蟲群落三者之間關(guān)系采用冗余分析，用Canoco 5軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 退耕還草土壤微生物群落變化

退耕還草土壤微生物群落組成發(fā)生改變。退耕種植紫花苜蓿草地中，共檢測出44種生物標(biāo)記的特征磷脂脂肪酸，在對照玉米田中，僅檢測到42種特征磷脂脂肪酸。在與未退耕農(nóng)田相比，退耕種植紫花苜蓿增加了土壤微生物群落磷脂脂肪酸含量。0-10 cm土層中，土壤微生物PLFAs的總量增加了59.13% (P ＜ 0.05)，放線菌PLFAs含量增加了64.35% (P ＜ 0.05)，細菌PLFAs含量增加64.34%(P ＜ 0.01)，真 菌PLFAs含 量 增 加135.19% (P ＜0.01)，革蘭氏陽性菌PLFAs含量增加68.88% (P ＜0.05)，革蘭氏陰性菌PLFAs含量增加85.83% (P ＜0.01)；10-20 cm土層中，土壤微生物PLFAs的總量增加了62.58% (P ＜ 0.05)，真菌PLFAs含量增加100.00% (P ＜ 0.05)，革蘭氏陽性菌PLFAs含量增加71.05% (P ＜ 0.05)，細菌PLFAs、放線菌PLFAs和革蘭氏陰性菌PLFAs含量分別增加52.18%、48.62%和57.92%，但均未達顯著差異(P ＞ 0.05) (圖1)。在退耕還草樣地和未退耕農(nóng)田中，均以細菌PLFAs含量占比最高，土壤中真菌PLFAs含量增長較快，真菌/細菌比值有增加趨勢，但未達顯著性差異，退耕還草對土壤真菌群落的影響高于細菌群落(圖1)。

圖 1 退耕還草土壤微生物PLFAs特征Figure 1 Phospholipid fatty acid (PFLA) characteristics of the soil microbes during the conversion of cropland to grassland

2.2 退耕還草條件下土壤微生物與理化因子之間的關(guān)系

退耕還草土壤微生物群落特征脂肪酸含量與土壤理化因子存在顯著相關(guān)關(guān)系(P ＜ 0.05)。土壤放線菌、細菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、微生物PLFAs總量與土壤含水量、硝態(tài)氮極顯著正相關(guān)(P ＜ 0.01)，與土壤pH和C/N比極顯著負相關(guān)(P ＜ 0.01)；土壤真菌PLFAs與土壤C/N比顯著負相關(guān)(P ＜ 0.05)；土壤放線菌、細菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和微生物PLFAs總量與土壤有機碳和全氮含量極顯著正相關(guān)(P ＜ 0.01)(表2)。F/B與土壤含水量顯著負相關(guān)(P ＜ 0.05)，與土壤pH顯著正相關(guān)，與土壤有機碳、全氮、硝態(tài)氮含量極顯著負相關(guān)(P ＜ 0.01)。

表 2 土壤微生物群落與土壤理化因子的相關(guān)性Table 2 Correlation between the soil microbial community and soil physical and chemical factors

2.3 退耕還草土壤微生物和土壤線蟲群落的相互作用

退耕還草土壤微生物群落和土壤線蟲群落相互作用。土壤微生物PLFAs含量與土壤線蟲數(shù)量之間極顯著正相關(guān)(P ＜ 0.01)，其中革蘭氏陰性菌與食細菌線蟲負相關(guān)(P ＜ 0.05)，與食真菌線蟲正相關(guān)(P ＜ 0.05)。細菌總量與通路指數(shù)顯著負相關(guān)(P ＜0.05)。革蘭氏陰性菌與通路指數(shù)極顯著負相關(guān)(P ＜0.01)，與土壤線蟲富集指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù)顯著正相關(guān)(P ＜ 0.05) (表3)。

表 3 土壤微生物群落與土壤線蟲的相關(guān)性Table 3 Relationship between the soil microbial community and soil nematodes

2.4 退耕還草土壤環(huán)境因子變化對土壤微食物網(wǎng)的影響

主成分分析表明，退耕還草以土壤微生物和土壤線蟲群落為主的土壤微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化(圖2)。PC 1和PC 2共解釋了總變異的94.53%，其中Axis 1解釋了總變異的89.86%，Axis 2解釋了總變異的4.67%。退耕還草樣地和未退耕農(nóng)田在PC 1上明顯分離，退耕還草土壤微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生分異。

圖 2 退耕還草土壤微生物和線蟲結(jié)構(gòu)的主成分分析Figure 2 Principal component analysis of the soil microorganisms and nematodes in the conversion of cropland to grassland

圖 3 土壤理化因子與土壤生物群的冗余分析Figure 3 Redundancy analysis between the soil properties and soil biota

土壤環(huán)境因子與土壤微生物和線蟲群落冗余分析(圖3)表明，RDA排序圖的典型軸1和軸2分別解釋退耕還草土壤微食物網(wǎng)的總體變異的86.10%和3.30%，其中pH (P = 0.046)，土 壤 有 機 碳(P =0.018)，硝態(tài)氮(P = 0.008)，全氮(P = 0.002)，C/N(P = 0.008)對土壤微生物和線蟲群落產(chǎn)生顯著影響，表明退耕還草土壤環(huán)境因子改變了土壤微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)。從RDA排序圖上可以看出，土壤環(huán)境因子對土壤微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)差異具有較大貢獻。土壤有機碳、全氮和硝態(tài)氮含量與土壤微生物群落正相關(guān)；土壤pH和C/N與土壤微生物群落負相關(guān)，表明土壤微生物群落受到土壤環(huán)境因子的調(diào)控作用極強。土壤線蟲群落與土壤微生物相比對土壤微食物網(wǎng)穩(wěn)定性貢獻更大。土壤微生物、細菌、真菌、放線菌與植物寄生性線蟲數(shù)量和土壤線蟲數(shù)量正相關(guān)，之間存在極強的相互作用，土壤食細菌線蟲與土壤微生物群落負相關(guān)，但與細菌/真菌比正相關(guān)，表明土壤食細菌線蟲的捕食作用改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。退耕還草通過改變土壤環(huán)境因子影響土壤微生物和線蟲群落變化，進而穩(wěn)定了土壤食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)。

3 討論與結(jié)論

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性受植被、土壤環(huán)境因子和凋落物的影響[29-31]。退耕還草通過植被、耕作和管理方式的變化對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。本研究通過PLFA法測定土壤微生物群落發(fā)現(xiàn)，丹江口水源涵養(yǎng)區(qū)退耕還草提高了土壤微生物磷脂脂肪酸含量，改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，與多數(shù)研究結(jié)果一致[3,12,32]，這是因為玉米長期種植導(dǎo)致土壤微生物總磷脂脂肪酸含量較低[33]，而紫花苜蓿具有極強的固氮能力，根系分泌物增加，不僅提高土壤養(yǎng)分含量，也為土壤微生物提供了更多的碳源，土壤微生物增加[34]。退耕還草土壤微生物群落中真菌比細菌有較高的增長速率，可能是因為土壤真菌和細菌偏好利用具有不同碳氮比的有機物。退耕還草土壤微生物群落與碳、氮養(yǎng)分正相關(guān)(P ＜ 0.05)，土壤微生物促進碳、氮循環(huán)過程，在物質(zhì)循環(huán)和能量流動過程中起重要作用，提升土壤生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能[35]。土壤pH和C/N是表征土壤資源有效性的主要指標(biāo)[36-37]，土壤pH和C/N降低與土壤微生物PLFAs負相關(guān)[37-38]，可能是因為pH的改變，土壤有機物分解過程發(fā)生變化，產(chǎn)生具有不同碳氮比的有機物質(zhì)，食物資源的改變引起土壤微生物結(jié)構(gòu)變化，但土壤微生物對不同有機物質(zhì)的利用能力還有待進一步研究。退耕還草顯著影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，有效的土壤管理措施和科學(xué)的利用方式有助于恢復(fù)土壤生態(tài)功能[39]。

退耕還草條件下土壤微生物群落和線蟲群落之間極顯著正相關(guān)(P ＜ 0.01)，這是因為土壤微生物數(shù)量的增加，為土壤線蟲提供了豐富的食物資源，從而線蟲數(shù)量增加，而土壤食微線蟲對微生物的適度捕食會促進土壤微生物數(shù)量和多樣性增加[40-42]，這是一個相互作用的過程。表示食微線蟲結(jié)構(gòu)比例的通路指數(shù)(NCR)與土壤細菌總量、革蘭氏陰性菌顯著相關(guān)(P ＜ 0.05)，革蘭氏陰性菌增加了食真菌線蟲數(shù)量，降低了食細菌線蟲數(shù)量，改變食微線蟲結(jié)構(gòu)，表明土壤線蟲食微結(jié)構(gòu)受到土壤微生物的調(diào)控。富集指數(shù)一般用于評估食物網(wǎng)對可利用資源的響應(yīng)，而結(jié)構(gòu)指數(shù)可以較好地指示干擾程度和食物網(wǎng)的變化[43]。土壤中革蘭氏陰性菌數(shù)量與土壤線蟲富集指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù)正相關(guān)，說明退耕還草提高了土壤革蘭氏陰性菌的活性，增加了可利用資源的有效性，降低了土壤受到的干擾程度，土壤微食物網(wǎng)更穩(wěn)定。土壤微生物和土壤線蟲之間的捕食關(guān)系構(gòu)成了土壤微食物網(wǎng)最重要的一部分，影響土壤有機質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)，增加了土壤可利用資源的有效性[44]，從而促進土壤生態(tài)效應(yīng)[20]。

土壤微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)的改變能夠影響土壤生態(tài)系統(tǒng)功能[45]，植物根系及其分泌物是土壤微食物網(wǎng)的主要物質(zhì)和能量來源[46]，退耕還草會引起土壤微食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)變化。退耕還草土壤微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生分異。冗余分析表明土壤環(huán)境因子的變化對土壤微食物網(wǎng)產(chǎn)生顯著影響。退耕還草土壤碳、氮養(yǎng)分和pH對土壤微生物和土壤線蟲群落的改變有極大的貢獻，這與Maaroufi等[47]研究結(jié)果類似，土壤碳、氮為土壤微生物提供了豐富的食物資源，土壤微生物反過來又可以分解和促進土壤養(yǎng)分循環(huán)。植物寄生性線蟲與土壤微生物群落正相關(guān)，土壤中食微線蟲結(jié)構(gòu)受到了土壤中C/N的調(diào)控，且真菌/細菌顯著影響了土壤食細菌線蟲和植物寄生性線蟲，說明退耕還草改變了植物群落和土壤養(yǎng)分條件，植物通過釋放大量的根系分泌物，不僅向微生物提供資源，還向植物寄生性線蟲提供資源[48]，從而調(diào)控土壤微生物活性和土壤線蟲結(jié)構(gòu)。在土壤微食物網(wǎng)中，與土壤微生物相比土壤線蟲群落穩(wěn)定性更高，這是因為土壤線蟲分布于土壤微食物網(wǎng)中多個營養(yǎng)級，對土壤環(huán)境因子變化具有緩沖作用。土壤線蟲通過與土壤微生物的相互作用，加速凋落物分解和養(yǎng)分釋放[49]，促進了土壤碳氮養(yǎng)分積累和轉(zhuǎn)化。土壤微生物和線蟲群落還會影響土壤的代謝墑和有機碳庫[4,50]，土壤環(huán)境因子與土土壤微生物和線蟲之間的相互作用還有待進一步研究。

綜上，丹江口水源涵養(yǎng)區(qū)退耕種植3年紫花苜蓿草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，多樣性增加，但真菌/細菌無顯著性差異。土壤微生物與土壤碳氮養(yǎng)分正相關(guān)(P ＜ 0.05)，與土壤pH和C/N負相關(guān)(P ＜ 0.05)，退耕還草促進了土壤碳氮養(yǎng)分的積累與轉(zhuǎn)化。土壤微生物和土壤線蟲相互作用，土壤革蘭氏陰性菌與土壤食細菌線蟲負相關(guān)，與食真菌線蟲正相關(guān)，改變了土壤食微線蟲結(jié)構(gòu)。土壤微生物與土壤線蟲富集指數(shù)和結(jié)構(gòu)指數(shù)顯著正相關(guān)(P ＜ 0.05)，表明退耕還草土壤微生物和線蟲的相互作用促進了土壤資源可利用性增加，降低了土壤受到的干擾，提高了土壤食物網(wǎng)穩(wěn)定性。退耕還草土壤微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生分異，環(huán)境因子對土壤微生物群落調(diào)控作用要大于土壤線蟲群落，土壤線蟲對土壤微食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性貢獻更大。