潘璇 田晟源 田洋 李全振 趙寶華

摘要：使用本實(shí)驗(yàn)室保存的重組菌株BL21（DE3）（pET-22b-m）經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)，并且經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，在21.6 Ku處有目的蛋白表達(dá);運(yùn)用乳化-復(fù)乳化的方法，制備IHNV-M蛋白微球疫苗。運(yùn)用灌胃的方法，將制備好的IHNV-M蛋白微球疫苗免疫虹鱒魚(yú)后，經(jīng)ELISA測(cè)定血清中抗體效價(jià)。普通虹鱒魚(yú)組和美國(guó)金鱒魚(yú)血清中抗體效價(jià)分別為1∶128 000和1∶25 600。

關(guān)鍵詞：造血器官壞死病病毒;基質(zhì)蛋白M;微球疫苗;免疫原性

造血器官壞死病病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）是一種線(xiàn)性單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae），諾拉彈狀病毒屬（Novirhabdovirus），可引起鱒魚(yú)等冷水魚(yú)患造血器官壞死?。╥nfectioushematopoietic necrosis， IHN）。IHN是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖鮭魚(yú)類(lèi)的一種非常重要的病毒性疾病，是中國(guó)的二類(lèi)疫病[1]。IHN是以鮭魚(yú)造血器官和其他內(nèi)臟器官的出血壞死為主要特征的急性、全身性、致死性的疾病;并且具有較強(qiáng)的致病性和高度傳染性[2-3]。虹鱒是我國(guó)主要冷水魚(yú)養(yǎng)殖種類(lèi)之一，IHN嚴(yán)重制約著我國(guó)冷水魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。目前我國(guó)對(duì)IHN陸續(xù)開(kāi)展了流行病學(xué)、病原學(xué)及防控技術(shù)等研究，取得了較大進(jìn)展。其中針對(duì)IHNV的檢測(cè)方法主要有免疫學(xué)方法[5]以及分子生物學(xué)方法[6-8]等。

本研究通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，基于本實(shí)驗(yàn)室之前對(duì)基質(zhì)蛋白M的研究[9]，利用乳化-復(fù)乳化的方法制備了IHNV-M微球疫苗，并且對(duì)所制備的微球疫苗進(jìn)行免疫原性分析，為IHNV的防治提供新的思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株及實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

菌株BL21（DE3）（pET-22b-m）和BL21（DE3）（pET-22b），由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。虹鱒魚(yú)取自河北省淶源縣昌源魚(yú)場(chǎng)（用于實(shí)驗(yàn)的虹鱒魚(yú)保證其體內(nèi)無(wú)抗體）。

1.2誘導(dǎo)重組菌株表達(dá)

將重組菌株BL21（DE3）（pET-22b-m）和轉(zhuǎn)化有空質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）（pET-22b）分別接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，條件為37 ℃，180 r/min，過(guò)夜搖培活化后接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，V（菌種）∶V（LB）=1∶100，37 ℃，200 r/min搖培，當(dāng) OD600達(dá)到0.4～0.6 時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，26 ℃，180 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h.誘導(dǎo)的菌體破碎后粗提可溶性蛋白。

1.3虹鱒魚(yú)M蛋白口服微球疫苗制備

取2 mL M蛋白抗原，加入2 mL 2%的海藻酸鈉溶液（4 ℃），加入8 mL大豆油（1%乳化劑Span80）用玻璃棒攪拌混勻后均值乳化（3檔，30 min）制備油水預(yù)乳液。使用注射器加2 mL 3%的CaCl2-乙酸溶液（4 ℃，60～90滴/min），預(yù)乳化后靜置30～60 min，吸出上層的油相和水，將混合液離心，8 000 r/min，5 min。使用生理鹽水（4 ℃）重懸洗滌沉淀3次，離心棄上清。加入6 mL 1%的殼聚糖溶液，預(yù)乳化后8 000 r，5 min，4 ℃離心，棄上清。再分別用75%乙醇和超純水各洗滌三次沉淀，離心棄上清。將沉淀轉(zhuǎn)移至玻璃培養(yǎng)皿中，加入超純水制成懸濁液（液面高度不超過(guò)1 cm），-80 ℃冷凍過(guò)夜后，轉(zhuǎn)至冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥。

1.4虹鱒魚(yú)M蛋白微球的包裹率及載抗原量的測(cè)定

稱(chēng)取100 mg凍干微球疫苗，加入10 mL 006 mol/L的檸檬酸三鈉溶液，超聲破碎10 min，4 ℃，4 000×g離心10 min，取上清液1 mL，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算回收抗原蛋白總量，重復(fù)3次取平均值。按以下公式計(jì)算微球的蛋白包裹率以及載抗原量。

包裹率（%）=M實(shí)測(cè)/M理論×100%

載抗原量（%）=M實(shí)測(cè)/M×100%

式中：M實(shí)測(cè)為實(shí)際測(cè)定的虹鱒魚(yú)M蛋白的質(zhì)量，M理論為理論上虹鱒魚(yú)M蛋白的質(zhì)量，M為測(cè)量所用的微球疫苗總質(zhì)量。

1.5虹鱒魚(yú)M蛋白微球疫苗的安全性試驗(yàn)

1.5.1免疫虹鱒魚(yú)血清中抗體效價(jià)的測(cè)定使用1 mL的注射器采集免疫虹鱒魚(yú)的血液樣本，每組隨機(jī)取5個(gè)樣本，做好標(biāo)記，4 ℃靜置3 h后離心，取血清，-20 ℃保存。

包被：用包被液將檢測(cè)抗原M蛋白稀釋。包被抗原濃度為10 μg/mL，然后按每孔100 μL加到酶標(biāo)板上，4 ℃過(guò)夜，酶標(biāo)板預(yù)先用紫外線(xiàn)處理15 min;封閉：用洗液洗板3次，將封閉液按每孔200 μL加入到酶標(biāo)板上，37 ℃放置30 min進(jìn)行封閉;加待測(cè)樣品：用洗液洗板3次后，對(duì)血清進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)僭诿笜?biāo)板孔中加入相應(yīng)稀釋好的血清。后放置于37 ℃，30 min;洗板三次，加入酶標(biāo)二抗，每孔100 μL，37 ℃放置30 min;加入顯色液：洗板三次，每孔加入100 μL顯色液，37 ℃放置30 min;加入終止液：每孔加入50 μL終止液;酶標(biāo)儀上450 nm下讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。

1.5.2分組及免疫實(shí)驗(yàn)用魚(yú)共4組，將規(guī)格為 75～150 g 的虹鱒魚(yú)隨機(jī)分為3組，分別為普通虹鱒空白對(duì)照組、普通虹鱒一組、普通虹鱒二組，另將規(guī)格為50 g左右的美國(guó)金鱒分為1組，每組50尾，將魚(yú)分好組放入小型養(yǎng)殖池中。為保證免疫劑量盡量精確，免疫方式采用灌胃法，每組的免疫劑量見(jiàn)表1，一免14 d后進(jìn)行二免，二免14 d、28 d、55 d后尾靜脈取血，測(cè)定M蛋白抗體的效價(jià)。

馴養(yǎng)一周，免疫前虹鱒魚(yú)禁食12 h。根據(jù)每組設(shè)定的免疫劑量稱(chēng)量疫苗（見(jiàn)表1），溶于400 μL的PBS。用灌胃針?lè)謩e灌服微球疫苗，空白對(duì)照組不做任何處理。將免疫好的虹鱒魚(yú)放回到正常的池中飼養(yǎng)。初次免疫后14 d同劑量加強(qiáng)免疫一次，空白對(duì)照組不做處理。14 d、28 d、55 d后，每組魚(yú)隨機(jī)取5尾魚(yú)，用1 mL注射器于尾靜脈處采血，用于測(cè)定M蛋白抗體的效價(jià)。

2結(jié)果

2.1虹鱒魚(yú)M蛋白微球疫苗粒徑、包裹率及載抗原量

虹鱒魚(yú)M蛋白微球疫苗粒徑8.0～28.0 μm，平均粒徑15.3 μm。微球平均包裹率為5710%。平均載抗原量為1.71%。

2.2虹鱒魚(yú)血清中抗體效價(jià)測(cè)定

用免疫血清為一抗，BL21（DE3）（pET-22b-m）表達(dá)產(chǎn)物為抗原，HRP-羊抗鼠IgG抗體為酶標(biāo)二抗，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明微球疫苗具有很好的免疫原性（見(jiàn)表2，表3，表4）。微球疫苗免疫55 d后普通虹鱒一組（免疫劑量為10 mg/尾）、普通虹鱒二組（免疫劑量為20 mg/尾）和美國(guó)金鱒組（免疫劑量為10 mg/尾）虹鱒魚(yú)血清中抗體效價(jià)分別為1∶12 800，1∶12 800，1∶25 600。

2.3虹鱒魚(yú)的微球疫苗免疫試驗(yàn)

將重組菌株BL21（DE3）（PET-22b-m）表達(dá)的M蛋白通過(guò)乳化-復(fù)乳化的方法制備成微球疫苗，采用灌胃的方法免疫虹鱒魚(yú)，對(duì)照組不做處理，二免2周后檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)，

結(jié)果表明，灌胃微球疫苗對(duì)普通虹鱒幼魚(yú)有一定的保護(hù)作用，其效價(jià)為1∶12 800。普通虹鱒一組和普通虹鱒二組表現(xiàn)出一樣抗體效價(jià)，說(shuō)明增加劑量對(duì)虹鱒魚(yú)的效價(jià)沒(méi)有太大影響。另外，使用相同劑量的微球疫苗對(duì)普通虹鱒魚(yú)和美國(guó)金鱒魚(yú)進(jìn)行免疫后，發(fā)現(xiàn)個(gè)體較小的美國(guó)金鱒魚(yú)血清中產(chǎn)生的抗體效價(jià)為1∶25 600，明顯高于普通虹鱒魚(yú)組，此結(jié)果說(shuō)明，該微球疫苗相對(duì)于虹鱒魚(yú)體重的免疫劑量越大效果越好。

3討論

春夏交替時(shí)節(jié)是虹鱒魚(yú)造血器官壞死?。↖HNV）的高發(fā)時(shí)節(jié)，給漁民帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。虹鱒魚(yú)幼魚(yú)在感染IHNV后會(huì)出現(xiàn)體色變黑，腹部膨脹，肛門(mén)處拖著不透明或棕褐色的假管型黏液糞便。魚(yú)鰓蒼白，頭部之后的側(cè)線(xiàn)上方皮下出血等癥狀，致死率高達(dá)100%[10]。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于IHNV的M蛋白的報(bào)道比較少見(jiàn)，對(duì)其疫苗的免疫效果研究也并不深入。本文中，作者采用乳化-復(fù)乳化法[11]利用海藻酸鈉-殼聚糖包被M蛋白， 通過(guò)灌胃微球疫苗的方法免疫虹鱒魚(yú)， 采用間接ELISA法檢測(cè)免疫后虹鱒魚(yú)的血清抗體水平。結(jié)果顯示， 通過(guò)灌胃微球疫苗免疫的虹鱒魚(yú)對(duì)IHNV具有明顯的抵抗作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)虹鱒魚(yú)IHNV的預(yù)防研究方法廣泛，例如：核酸疫苗[12]、活載體疫苗[13]、滅活苗[14]、DNA疫苗[15]等。本文主要研究的是蛋白疫苗，目前，這種疫苗的可控性較高，并且可以達(dá)到免疫劑量好控制、免疫方法易操作的目標(biāo)。故本文研究的蛋白疫苗更有應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] LaPATRA， SCOTT E.The use of serological techniques for virus surveillance and certification of finfish[J]. Annual Review of Fish Diseases， 1996， 6（（not defined））：15-28.

[2] 茆安婷， 尹玉偉， 代靜，等. 傳染性造血器官壞死病毒研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志， 2017（10）：88-91.

[3] 王全意. 虹鱒魚(yú)傳染性造血器官壞死病防控技術(shù)[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī)， 2018， 48（08）：63-65.

[4] 胡潛. 傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技（07）：273-277.

[5] 焦雪， 吉尚雷， 張培軍， 等. 傳染性造血器官壞死病病毒（IHNV）分離株病原學(xué)研究及全基因組序列分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志， 2017（03）：41-44.

[6] 高欣. 虹鱒魚(yú)IHNV甘肅分離株全基因圖譜的繪制及滅活苗的研制[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017：44-51.

[7] KIM C H ， DUMMER D M ， CHIOU P P，et al. Truncated particles produced in fish surviving infectious hematopoietic necrosis virus infection： Mediators of persistence[J]. Journal of Virology， 1999， 73（1）：843-849.

[8] ARN MARTINEZ. Nested PCR improves detection of infectious hematopoietic necrosis virus in cells coinfected with infectious pancreatic necrosis virus.[J]. Journal of Virological Methods， 1999， 81（1-2）：1-9.

[9] 安紅艷， 孫紅巖， 高潔，等. 虹鱒魚(yú)造血器官壞死病病毒（IHNV）m基因的表達(dá)及免疫原性分析[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2016（5）：434-438.

[10] 李守湖. 傳染性造血器官壞死癥活載體疫苗的研制[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017：44-48.

[11] 包德才， 樊兆敏， 趙瑩，等. 膜乳化-復(fù)乳化法制備載蛋白高分子微球[J]. 渤海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2008， 29（4）：303-307.

[12] 李淵， 趙景壯，劉淼，等. 傳染性造血器官壞死病核酸疫苗的構(gòu)建及其抗性基因?qū)Νh(huán)境細(xì)菌抗性的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2018，25（1）：220-227.

[13] 李守湖. 傳染性造血器官壞死癥活載體疫苗的研制[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017：33-43.

[14] 高欣. 虹鱒魚(yú)IHNV甘肅分離株全基因圖譜的繪制及滅活苗的研制[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017：44-50.

[15] BALLESTEROS N A ， ALONSO M ， SYLVIA RODRIGUEZ SAINT-JEAN， et al. An oral DNA vaccine against infectious haematopoietic necrosis virus （IHNV） encapsulated in alginate microspheres induces dose-dependent immune responses and significant protection in rainbow trout （Oncorrhynchus mykiss）[J]. Fish Shellfish Immunol， 2015， 45（2）：877-888.

Preparation and Immune Effect of Rainbow Trout IHNV-M Protein Microsphere Vaccine

PAN xuan1，TIAN Shengyuan1，TIAN Yang2，LI Quanzhen2，ZHAO Baohua1

（1.College of Life Sciences， Hebei Normal University， Shijiazhuang 050024， China; 2. Hebei Provincial Fisheries Technology Extension Center， Shijiazhuang 050035， China）

Abstract：The recombinant strain BL21（DE3） （pET-22b-m） preserved in our laboratory was induced by IPTG， and confirmed by SDS-PAGE;the target protein was expressed at 21.6Ku. IHNV-M protein microsphere vaccine was prepared by emulsification-double emulsion method. ?The prepared IHNV-M protein microsphere vaccine was used to immunize rainbow trout with the method of intragastric administration， and the antibody titer in serum was determined by ELISA. The antibody titers in the serum of the common rainbow trout group and the American golden trout were 1∶128 000 and 1∶25 600， respectively.

Key words：hematopoietic necrosis virus; matrix protein M; microsphere vaccine; immunogenicity