林軒，王浩，崔云甫

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 膽胰外科，黑龍江 哈爾濱 150086）

根據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我國每年新增胰腺癌患者9萬人，死于胰腺癌的患者7.9萬人，患者的5年生存率僅為6%[1]。胰腺癌起病隱匿，診斷明確時往往已是晚期，獲得根治性手術(shù)的幾率低，且術(shù)后并發(fā)癥多，復(fù)發(fā)率高。因胰腺癌具有高度異質(zhì)性，其對放、化療的敏感性差，缺乏特定的診療靶點。因此，尋找有效的靶點對于胰腺癌的診斷和治療都至關(guān)重要。

黏蛋白（Mucin）家族，包括21種大分子糖蛋白。該家族的蛋白在胰腺癌中均存在異常表達及修飾，且與胰腺癌的不良預(yù)后相關(guān)[2]。黏蛋白-4（MUC4）是該家族的成員之一。MUC4兼具膜結(jié)合型蛋白和分泌型蛋白的特點（圖1）[3]，最早于1991年在氣管-支氣管黏液中發(fā)現(xiàn)[4]。胰腺癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，在黏蛋白家族中，MUC4的過表達最為顯著[5]。在正常胰腺導(dǎo)管組織中，難以檢測到MUC4的RNA。然而，在胰腺上皮內(nèi)瘤變的初始階段即可檢測到MUC4 RNA，且隨著疾病的進展，MUC4 RNA表達水平逐漸升高[6]。MUC4可以誘導(dǎo)細胞分化，促進腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，甚至與腫瘤的化療耐藥有關(guān)[7]。本文綜述MUC4結(jié)構(gòu)、功能及在胰腺癌中限制MUC4表達的方法。最后，我們展望以MUC4為治療靶點所面臨的挑戰(zhàn)。

圖1 MUC4的表達分布6

1 MUC4的結(jié)構(gòu)

MUC4基因位于染色體的3q21區(qū)域，包含5 513個堿基對，最早由Porchet等[4]于1991年從氣管-支氣管黏膜cDNA文庫中篩選出。由于MUC4分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此，其完整的序列直到1999年才被Moniaux等[8]鑒定出來。MUC4蛋白是一種跨膜糖蛋白，包含一段具有高度等位基因多態(tài)性、數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat，VNTR），因此，其主鏈分子量長達550～930 kDa。MUC4蛋白能在GDPH位點發(fā)生蛋白水解，分解成兩個亞基：較大的MUC4α和較小的MUC4β[9]。MUC4α由一個由富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸殘基的VNTR區(qū)域組成，并由大小、組成、結(jié)構(gòu)各不相同的寡糖側(cè)鏈修飾[10]。VNTR區(qū)域下游是黏著相關(guān)（AMOP）結(jié)構(gòu)域和類巢蛋白（NIDO）結(jié)構(gòu)域。MUC4β包含1個血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWD）結(jié)構(gòu)域、3個類表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣結(jié)構(gòu)域、1個跨膜蛋白和1段22個氨基酸構(gòu)成的胞內(nèi)片段（cytoplasmic tail，CT）。其中，NIDO、AMOP和vWD是屬于MUC4的獨特結(jié)構(gòu)域，不存在于其他的黏蛋白中[11]（圖2）。

圖2 MUC4的結(jié)構(gòu)示意圖[12]。MUC4可在GDPH位點分解為MUC4α和MUC4β。MUC4α包含一段數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域（tandem repeat region）類巢蛋白（NIDO）結(jié)構(gòu)域和黏著相關(guān)（AMOP）結(jié)構(gòu)域。MUC4β包含1個血管性血友病因子（vWD）結(jié)構(gòu)域、3個類表皮生長因子（EGF）樣結(jié)構(gòu)域、1個跨膜蛋白和1段22個氨基酸構(gòu)成的胞內(nèi)片段（CT）。

2 MUC4的表達

2.1 MUC4的生理性表達

在多種組織，如食管，空腸，結(jié)腸，回腸中都能檢測到MUC4 RNA[13]，但在肝臟、膽道和胰腺組織中尚未檢測到MUC4 RNA[14]。MUC4是一種跨膜黏蛋白，但其在GDPH位點發(fā)生的蛋白水解，使其成為一種分泌型蛋白，從而能在唾液、乳液和淚液等分泌物中檢測到其RNA[12]。

2.2 MUC4在胰腺組織與癌組織中的表達

在正常胰腺和慢性胰腺炎等炎癥性疾病中無法檢測到MUC4的表達，但在胰腺癌的癌前病變中即可檢測到MUC4的表達，并且其表達水平隨胰腺癌的進展而逐漸升高[6]。2002年，Swartz等[15]在胰腺組織的免疫組化染色結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，MUC4染色陽性率由胰腺上皮內(nèi)瘤變（n=30）中的17%逐漸增加至胰腺癌中的89%（n=28）。2006年，Jhala等[16]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中，90%以上的組織樣本的MUC4染色為陽性（n=40，P＜0.01）。2008年，Yonezawa等[6]發(fā)現(xiàn)胰腺癌中MUC4的染色陽性率是導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤（IPMNs）的2倍。這表明從IPMNs到胰腺癌的過程中，MUC4的表達顯著提高。2013年，Ansari等[17]發(fā)現(xiàn)MUC4染色陽性率在胰腺癌原發(fā)灶和腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中呈高度一致性（82%），這提示MUC4在轉(zhuǎn)移過程中持續(xù)表達。MUC4或許可以成為胰腺癌的腫瘤標志物。但以上研究僅基于術(shù)后病理的免疫組化染色，胰腺癌患者的血液或體液中MUC4的表達水平與正常人是否存在差異還有待驗證，這也是MUC4能否成為腫瘤標志物的關(guān)鍵。

3 MUC4在胰腺癌中的作用

3.1 MUC4對癌細胞的影響

在胰腺癌中，MUC4通過類EGF樣結(jié)構(gòu)域與EGFR家族的生長因子受體，如正常上皮基底外側(cè)的人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor，HER2）和人類表皮生長因子受體-3（HER3）相互作用。Carraway等[18]發(fā)現(xiàn)在大鼠體內(nèi)，MUC4/Asgp2/Sialomucin復(fù)合物中的兩個類EGF樣結(jié)構(gòu)域能夠調(diào)節(jié)原癌基因ERBB2的活性。人MUC4蛋白包含3個類EGF樣結(jié)構(gòu)域，這三個結(jié)構(gòu)域能與ERBB3結(jié)合形成穩(wěn)定的異源二聚體[19]。該二聚體可以激活MAPK、JNK和STAT-1等信號通路，從而促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[20]。MUC4還能調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白信號通路，促進細胞錨定非依賴性增殖及上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化[21]。此外，MUC4蛋白中大的寡糖側(cè)鏈可以形成空間障礙，從而阻止配體與受體相互作用，并破壞正常的細胞-細胞和細胞-基質(zhì)間的相互作用[22]且其調(diào)控細胞進程的能力與細胞密度相關(guān)[23]。

3.2 MUC4在腫瘤微環(huán)境中的作用

MUC4蛋白具有膜結(jié)合型蛋白的特點，能從細胞表面延伸，與細胞外基質(zhì)中的成分（如蛋白、免疫細胞、血管內(nèi)皮等）發(fā)生相互作用[10]。在MiaPaCa胰腺癌細胞系中，Senapati等[7]發(fā)現(xiàn)MUC4中NIDO結(jié)構(gòu)域的缺失，能使癌細胞與細胞外基質(zhì)中的Fibulin-2的黏附減少，癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低。MUC4也能與免疫細胞相互作用。Komatsu等[24]發(fā)現(xiàn)，唾液黏蛋白復(fù)合物（大鼠MUC4同源物）可以隱蔽細胞表面的腫瘤相關(guān)抗原表位，使免疫細胞對其的殺傷能力減弱，從而實現(xiàn)免疫逃逸。Zhu等[25]發(fā)現(xiàn)MUC4可以不依賴Fas配體，通過細胞-細胞接觸的方式增加特異性細胞毒性T細胞（CTL）的凋亡。Inman等[26]發(fā)現(xiàn)相較其他免疫細胞，胰腺腫瘤中CTL豐度較低。但這個現(xiàn)象背后的機制尚不明確，MUC4與CTL之間的關(guān)系還需要進一步驗證。

2012年，Geng等[27]證明了MUC4可以與表達E-選擇素、P-選擇素的內(nèi)皮細胞相互作用，促進內(nèi)皮細胞之間的黏附和腫瘤的轉(zhuǎn)移。Senapati等[28]發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的半乳糖苷-3可與MUC4結(jié)合，使MUC4積聚，增強MUC4與內(nèi)皮細胞的相互作用，并促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。2016年，Tang等[29]發(fā)現(xiàn)，MUC4/Y中的AMOP結(jié)構(gòu)域?qū)ρ軆?nèi)皮生長因子A和血管生成素2的表達有顯著影響，該結(jié)構(gòu)域的缺失明顯減少了胰腺癌細胞周圍血管的生成。2017年，Zhu等[11]編碼了敲除特定結(jié)構(gòu)域的MUC4基因，建立了一系列NIDO、AMOP和vWD結(jié)構(gòu)域被單獨或同時刪除的MUC4/Y蛋白，并在BXPC-3細胞系中證明，這些結(jié)構(gòu)域的缺失能降低胰腺細胞的癌變率。在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的過程中，這三個結(jié)構(gòu)域起到相互促進的作用。

3.3 MUC4與化療耐藥

吉西他濱是胰腺癌一線化療方案的首選藥物之一。2009年，Bafna等[30]發(fā)現(xiàn)MUC4通過調(diào)控HER2受體來減少細胞色素C的釋放，從而抑制吉西他濱介導(dǎo)細胞凋亡的功能，并誘導(dǎo)癌細胞對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性。2010年，Hagmann等[31]發(fā)現(xiàn)MUC4的過表達導(dǎo)致幾種關(guān)鍵的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白和多藥耐藥蛋白高表達。2012年，Skrypek等[32]發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中，MUC4與核苷轉(zhuǎn)運蛋白-1的表達呈正相關(guān)。MUC4在胰腺癌細胞中的過表達使核苷轉(zhuǎn)運蛋白的表達升高，促使細胞將內(nèi)部的吉西他濱轉(zhuǎn)運至胞外，從而增強癌細胞對化療藥物的耐藥性。2014年，Ansari等[33]證明下調(diào)MUC4的表達可以提高吉西他濱對癌細胞的化療敏感性。2017年，Urey等[34]進一步證實了MUC4表達的臨床意義：在腫瘤可切除和接受吉西他濱治療的胰腺癌患者中，MUC4高表達與患者的不良預(yù)后相關(guān)。以上研究為MUC4介導(dǎo)的腫瘤細胞化療耐藥提供了依據(jù)，針對MUC4的靶向治療能阻止腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，有望改善患者的預(yù)后。

4 以MUC4為靶點治療胰腺癌的方法

隨著對MUC4的深入研究，對其在胰腺癌中的作用和機制有了進一步的了解，為以其為靶點的治療方案提供了有力的支持。由于MUC4在胰腺癌中過表達，最直接的方法即通過基因沉默下調(diào)其表達。其次，則或通過藥物抑制使MUC4上調(diào)的信號通路，間接下調(diào)MUC4的表達。

4.1 通過RNA調(diào)控MUC4的表達

2004年，Singh等[35]通過含有抗MUC4的RNA質(zhì)粒沉默胰腺癌細胞系中的MUC4基因，證明了下調(diào)MUC4的表達可以抑制癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。2008—2012年，Chaturvedi等[36]和Jonckheere等[20]先后通過靶向MUC4的寡核苷酸和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來下調(diào)MUC4的表達。MUC4表達的下調(diào)能降低HER2的穩(wěn)定性，從而使腫瘤的活性降低。此外，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體下調(diào)MUC4的表達可以提高吉西他濱對癌細胞的化療敏感性[32]。2016年，Li等[37]在BxPC-3細胞系中證明抗MUC4的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。但是，基于RNA載體來沉默MUC4基因的方法尚未在動物體內(nèi)實驗中驗證其效應(yīng)。在生物體內(nèi)，將逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他RNA載體精準遞送到指定區(qū)域并確保其正常表達的方法尚未提出。在體內(nèi)，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他RNA載體來調(diào)控MUC4的表達仍是一個挑戰(zhàn)。

4.2 藥物調(diào)控MUC4的表達

現(xiàn)已知，以地塞米松為代表的糖皮質(zhì)激素及EGFR抑制劑對MUC4有調(diào)控作用。在1995年，Gollub等[38]最早發(fā)現(xiàn)在部分氣道上皮細胞中，地塞米松能夠上調(diào)MUC4的表達。2007年，Bai等[39]發(fā)現(xiàn)，在角膜、鼻息肉來源的上皮細胞中，地塞米松可以下調(diào)MUC4的表達。隨后，2008年，Martinez等[40]發(fā)現(xiàn)，口服或鼻內(nèi)吸入皮質(zhì)類固醇，會提高鼻息肉中MUC1和MUC4的表達水平。2010年，Woo等[41]則發(fā)現(xiàn)地塞米松對鼻黏膜中MUC4的表達沒有影響。在胰腺外科的臨床實踐中，地塞米松經(jīng)常應(yīng)用于圍手術(shù)期的處理，同時也經(jīng)常作為輔助用藥，應(yīng)用于化療、放療中。但這些臨床應(yīng)用是基于糖皮質(zhì)激素的基本藥理學(xué)效應(yīng)，所以使用時間相對短暫。其針對MUC4表達的調(diào)控能力具有潛在的使用價值。但是，考慮到地塞米松對MUC4的調(diào)控尚存在爭議，在胰腺癌中，其對MUC4的作用還需進一步評價。

EFGR抑制劑，如厄洛替尼，阿法替尼和卡奈替尼等可與吉西他濱聯(lián)用，治療晚期胰腺癌[42]。2008年，Chaturvedi等[36]發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中，MUC4可與EGFR家族中的受體，如HRB1、HRB2等協(xié)同作用，加速疾病的進展。2015年內(nèi)，Seshacharyulu等[43]證明卡奈替尼和阿法替尼可下調(diào)胰腺癌中MUC4的表達，但只有卡奈替尼下調(diào)MUC4表達的過程是不可逆的。而厄洛替尼對MUC4的調(diào)節(jié)作用尚不明確。EGFR受體抑制劑可調(diào)控MUC4的表達，但該類藥物作用廣泛，還可以作用于ERK1、cyclinD1、cyclinA、PAKT等信號通路或細胞因子來抑制胰腺癌的活性，其通過調(diào)控MUC4表達來抑制胰腺癌進展的機制還有待進一步明確。

4.3 基于MUC4的免疫療法

免疫反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，腫瘤免疫學(xué)也是當(dāng)前的研究熱點。在胰腺癌中，因為腫瘤的高度異質(zhì)性，缺乏相應(yīng)抗原表位，所以免疫療法一直沒有被深入研究。有效的抗原表位，必須滿足以下三個條件：在腫瘤中的表達具有特異性；腫瘤中表達量大；免疫原性強，足以引起免疫應(yīng)答[44]。MUC4符合抗原表位的標準。MUC4在全身正常組織中都存在表達，但其在胰腺癌中過表達，且出現(xiàn)了異常糖基化，此特點可與正常組織中的MUC4區(qū)分[45]。此外，胰腺癌中的MUC4具有較強的免疫原性。Chen等[46]在體外實驗中證明，針對胰腺癌細胞，轉(zhuǎn)染腫瘤相關(guān)抗原生存素的樹突細胞可以介導(dǎo)強大的CTL反應(yīng)。若同時將MUC4與生存素的mRNA轉(zhuǎn)染入樹突細胞，誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)較前者更為強大。MUC4還可以單獨或與其他抗原聯(lián)合，研制針對胰腺癌的特異性疫苗。但是，由于缺乏相應(yīng)的動物模型，難以在體內(nèi)還原正常和腫瘤特異性的MUC4蛋白，該研究無法進一步深入。此外，MUC4抗體也有望在治療胰腺癌過程中起效[47]。已有實驗中心針對MUC4的各個區(qū)域的特定結(jié)構(gòu)，如串聯(lián)重復(fù)序列、獨特結(jié)構(gòu)域、N端等，制作了不同的抗體[48]，但其細胞毒性、藥物傳遞方式及抗腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移的能力還有待進一步評估。

5 展望

MUC4在正常胰腺組織中不表達，而從胰腺癌前病變至胰腺癌的過程中，表達逐漸增加且存在異常糖基化并能激活免疫反應(yīng)。這使MUC4有望成為胰腺癌的治療靶點。一系列體內(nèi)和體外的實驗驗證了通過藥物抑制劑，RNA載體和免疫療法來治療胰腺癌的潛力。但是，想將其投入臨床仍存在巨大的挑戰(zhàn)。在免疫療法中，由于胰腺癌中的MUC4蛋白存在異常糖基化，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，難以選擇有效的抗原表位及抗體。通過RNA載體調(diào)節(jié)MUC4的表達時，缺少能將RNA載體遞送至胰腺癌區(qū)域的精準遞送系統(tǒng)。因為這些障礙，以MUC4為靶點的胰腺癌療法的研究仍處于早期階段。面對這些挑戰(zhàn)，未來的研究應(yīng)該集中在以下幾個方面：（1）研發(fā)胰腺癌動物模型來評估MUC4靶向藥物的療效；（2）構(gòu)建胰腺癌中MUC4的特異性結(jié)構(gòu)并測試其免疫原性；（3）在體內(nèi)尋找有效的遞送系統(tǒng)將藥物準確投遞到胰腺癌區(qū)域；（4）尋找新的方法或特異性藥物下調(diào)MUC4的表達。