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        香煙提取物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞抗衰老因子Klotho的影響分析及應(yīng)對(duì)措施的效果研究

        2019-12-11 03:49:30楊林賈欽堯宋珊
        安徽醫(yī)藥 2019年12期
        關(guān)鍵詞:香煙外周血提取物

        楊林,賈欽堯,宋珊

        慢性阻塞性肺疾病(簡(jiǎn)稱“慢阻肺”)是一種慢性炎性疾病,臨床以持續(xù)、進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限為主要特征,研究表明其發(fā)生與人體過多吸入香煙煙霧或顆粒等有害刺激物引發(fā)的氣道炎癥有關(guān)[1-2]。氣道上皮是肺與外界接觸的第一道屏障,人支氣管上皮細(xì)胞(Human bronchial epithelial cells,HBE)分布于氣管腔內(nèi)表面,在抵御病原體、有害氣體、過敏原等外來(lái)刺激過程中發(fā)揮重要作用,對(duì)于維持正常的氣道功能具有重要作用,其異常調(diào)控會(huì)影響肺組織對(duì)外來(lái)刺激物的防御能力[3-5]。在病理?xiàng)l件下,受到致病因素的反復(fù)刺激,HBE細(xì)胞會(huì)釋放多種炎性介質(zhì)和趨化因子,使機(jī)體局部免疫反應(yīng)增強(qiáng),進(jìn)而活化多種炎癥細(xì)胞[6-8]。有研究表明抗衰老因子Klotho在HBE細(xì)胞中有著較高的表達(dá)量,且其在健康人群中的表達(dá)水平高于吸煙人群,在慢阻肺病人中的表達(dá)水平偏低[9]。同時(shí)外源性重組Klotho蛋白能夠下調(diào)白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)mRNA 的 表 達(dá) 水平[10]。相關(guān)研究認(rèn)為吸煙可增加慢阻肺的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11],因此本研究擬以HBE細(xì)胞為研究對(duì)象,探討香煙提取物對(duì)HBE細(xì)胞抗衰老因子Klotho的影響及相關(guān)治療措施的效果。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 以2016年3月至2017年8月在儀隴縣人民醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康人員30例作為對(duì)照組,其中男20例,女性10例,年齡(61.32±6.78)歲,范圍為45~73歲。選擇同期在該院經(jīng)肺功能檢查確診的慢阻肺病人30例,除合并高血壓、糖尿病、冠心病、自身免疫系統(tǒng)疾病、癌癥、哮喘、結(jié)核病等嚴(yán)重疾病,且近2周內(nèi)未使用茶堿或糖皮質(zhì)激素,其中男性21例,女性9例,年齡(60.54±6.44)歲,范圍為45~72歲。兩組人群性別比例(χ2=1.021,P=0.102)、年齡(t=0.812,P=0.412),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBE細(xì)胞購(gòu)于北京腫瘤研究所。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求,病人或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書。

        1.2 香煙提取物制備取兩根剪去過濾嘴的香煙,在改良的注射器驅(qū)動(dòng)裝置一端點(diǎn)燃,使香煙燃燒產(chǎn)生的煙霧以50 mL/min的速度通過該裝置,并使其溶在10 mL 1640培養(yǎng)基中。之后調(diào)節(jié)溶液PH值為7.4,再以0.22 μm微孔濾器過濾。香煙提取物需現(xiàn)用現(xiàn)制,并保證每次在制備后的30 min內(nèi)開始使用。上述方法制備的香煙提取物為100%,使用時(shí)以1640培養(yǎng)基稀釋至合適濃度。

        1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理HBE細(xì)胞使用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng),在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng),每2~3天進(jìn)行1次傳代,在細(xì)胞對(duì)數(shù)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HBE細(xì)胞,以2×105/mL的密度接種于6孔板,分為對(duì)照組(A組),模型組(B組),陽(yáng)性對(duì)照組(C組),地塞米松低劑量組(D組)、地塞米松中劑量組(E組)、地塞米松高劑量組(F組)(其中D、E、F組為實(shí)驗(yàn)組),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,共3塊6孔板。陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入1%香煙提取物處理24 h,之后陽(yáng)性對(duì)照組給予外源性200×10-12mol/L Klotho蛋白處理,實(shí)驗(yàn)組分別在共培養(yǎng)1 h后分別給予1×106mol/L,1.5×106mol/L和2×106mol/L的地塞米松。

        1.4 觀察指標(biāo)及方法 (1)健康與慢阻肺人群外周血細(xì)胞因子mRNA表達(dá)檢測(cè),采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)兩組外周血細(xì)胞因子IL-8、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、Klotho表達(dá)水平。(2)ELISA檢測(cè)不同刺激條件下HBE細(xì)胞釋放炎性因子水平,收集藥物處理24 h及對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,-20℃保存,測(cè)定時(shí)從冰箱取出試劑盒,在室溫下平衡,各孔分別加入50 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品,輕輕混勻1 min,以密封膜密封,25℃孵育2 h;之后倒掉板內(nèi)液體,每個(gè)孔中加入250 μL洗滌液洗滌,再次倒掉液體,反復(fù)洗滌5次,最后拍干。之后依次進(jìn)行加50 L生物素標(biāo)記抗體于樣品或標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi),洗板,加100 L辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素鏈菌素(Streptavidin-HRP)酶聯(lián)二抗溶液于各孔,用密封膜封住板孔,37 ℃孵育45 min;洗板,加100 L 3,3’,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液,室溫避光反應(yīng)孵育30 min;每孔分別加入100 μL終止反應(yīng)液;使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。(3)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)不同刺激條件下HBE細(xì)胞釋放炎性因子mRNA水平,收集藥物刺激3 h及對(duì)照組細(xì)胞樣品,每個(gè)樣品加入1 mL Trizol試劑,吹打收集細(xì)胞樣品于1.5 mL無(wú)RNA酶離心管,指彈,室溫靜置15 min,存放于-20℃保存?zhèn)溆?。測(cè)定時(shí),采用RNA提取試劑盒提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,最后采用RT-qPCR進(jìn)行測(cè)定。引物由Invitrogen公司合成,引物序列如下,Human IL-8:sense,5′-CTCTTGGCAGCCTTCCTGATT-3′Antisense,5′-TATGCACTGACATCTAAGTTCTTTAGCA-3’;Human IL-6:sense,5′-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3′Antisense,5′-CATCTTTGGAAGGTTCAGGTTGT-3′。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料滿足方差齊性和正態(tài)分布,采用xˉ±s表示,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,在方差分析有意義的基礎(chǔ)上,再采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多組間的兩兩比較;計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。均以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 健康與慢阻肺人群外周血細(xì)胞因子檢測(cè)慢阻肺病人外展血IL-8,IL-6及TNF-α含量均顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);慢阻肺病人外周血Klotho蛋白含量顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

        表1 健康與慢阻肺人群外周血細(xì)胞因子檢測(cè)/(pg/mL,xˉ±s)

        2.2 ELISA檢測(cè)各組HBE細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平 如下表2所示,單因素方差分析結(jié)果顯示,各組間IL-8、IL-6和TNF-α均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)組間兩兩比較結(jié)果顯示,B組細(xì)胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組細(xì)胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α表達(dá)水平高于D、E、F組,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D、E、F組細(xì)胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α含量依次降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        表2 ELISA檢測(cè)各組HBE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性因子含量/(pg/mL,xˉ±s)

        2.3 RT-PCR檢測(cè)各組HBE細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平如下表3所示,單因素方差分析結(jié)果顯示,各組間IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)組間兩兩比較結(jié)果顯示,B組細(xì)胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組細(xì)胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平高于D、E、F組,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D、E、F組細(xì)胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平依次降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        表3 RT-PCR檢測(cè)各組HBE細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá)水平/xˉ± s

        3 討論

        煙草煙霧中含有大量的自由基和其他多種有毒物質(zhì),對(duì)人體可造成多種危害,如細(xì)胞癌變、氣道損傷以及肺功能障礙等[12-13]。其中,長(zhǎng)期吸煙病人慢阻肺的發(fā)病率明顯偏高,其主要發(fā)病機(jī)制為慢性氣道炎癥、上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。研究表明,中性粒細(xì)胞激活在吸煙引起的肺功能損傷過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用,其中IL-8、IL-6和TNF-α等炎性因子在中性粒細(xì)胞趨化過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。在此背景下,本研究首先對(duì)健康人群及慢阻肺人群肺功能和外周血細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平進(jìn)行分析,進(jìn)而通過以HBE細(xì)胞構(gòu)建模型,探討抗炎藥地塞米松對(duì)香煙提取物誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞炎性因子升高的影響,為臨床選擇合理的治療方式提供依據(jù)。

        本研究結(jié)果表明慢阻肺病人外展血IL-8,IL-6及TNF-α水平均顯著高于對(duì)照組;慢阻肺病人外周血Klotho蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。上述結(jié)果說(shuō)明慢阻肺病人外周血炎性因子含量顯著升高,這與相關(guān)研究[14-15]報(bào)道基本相符。此外,慢阻肺Klotho蛋白含量表達(dá)顯著降低,Klotho作為一種Ⅰ型跨膜蛋白,在腎臟、大腦組織分別較多,具有重要的生物功能。有研究表明Klotho基因發(fā)生突變的小鼠可表現(xiàn)出類似肺氣腫的多種癥狀,如出現(xiàn)肺泡壁斷裂、肺泡腔變大、呼吸時(shí)間變長(zhǎng)等。因此,Klotho蛋白功能異??赡芘c肺氣腫形成,進(jìn)而影響慢阻肺病情進(jìn)展。

        此外,體外實(shí)驗(yàn)表明,B組細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-8、IL-6、TNF-α含量顯著高于A組,這一結(jié)果表明以香煙提取物作為體外刺激HBE細(xì)胞構(gòu)建支氣管慢性炎癥的模型是成功的。B組細(xì)胞IL-8、IL-6、TNF-α含量高于D、E、F組。D、E、F組細(xì)胞IL-8、IL-6、TNF-α含量依次降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)RT-qPCR結(jié)果,B組細(xì)胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著高于A組。B組細(xì)胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平高于D、E、F組。D、E、F組細(xì)胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平依次降低。上述結(jié)果說(shuō)明,地塞米松能夠下調(diào)香煙提取物引起的HBE細(xì)胞炎性因子分泌增加。其原因可能是地塞米松能夠減輕和避免組織對(duì)炎癥的過度反應(yīng),從而有助于減輕臨床多種炎癥表現(xiàn)。此外,作為一種激素類藥物,其能抑制包括巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在炎癥部位聚集,同時(shí)抑制吞噬作用、溶酶體酶的釋放,對(duì)多種炎癥化學(xué)中介物的合成和釋放均可產(chǎn)生影響[16-17]。從而有助于炎性因子水平的降低,緩解炎性癥狀。

        綜合上述分析,可得出結(jié)論,香煙提取物體外刺激HBE細(xì)胞,可顯著降低Klotho因子含量,同時(shí)上調(diào)多種炎性因子基因的表達(dá),體外給予地塞米松干預(yù)能夠降低HBE細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

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