楊林，賈欽堯，宋珊

慢性阻塞性肺疾病（簡(jiǎn)稱(chēng)“慢阻肺”）是一種慢性炎性疾病，臨床以持續(xù)、進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限為主要特征，研究表明其發(fā)生與人體過(guò)多吸入香煙煙霧或顆粒等有害刺激物引發(fā)的氣道炎癥有關(guān)［1-2］。氣道上皮是肺與外界接觸的第一道屏障，人支氣管上皮細(xì)胞（Human bronchial epithelial cells，HBE）分布于氣管腔內(nèi)表面，在抵御病原體、有害氣體、過(guò)敏原等外來(lái)刺激過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)于維持正常的氣道功能具有重要作用，其異常調(diào)控會(huì)影響肺組織對(duì)外來(lái)刺激物的防御能力［3-5］。在病理?xiàng)l件下，受到致病因素的反復(fù)刺激，HBE細(xì)胞會(huì)釋放多種炎性介質(zhì)和趨化因子，使機(jī)體局部免疫反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)而活化多種炎癥細(xì)胞［6-8］。有研究表明抗衰老因子Klotho在HBE細(xì)胞中有著較高的表達(dá)量，且其在健康人群中的表達(dá)水平高于吸煙人群，在慢阻肺病人中的表達(dá)水平偏低［9］。同時(shí)外源性重組Klotho蛋白能夠下調(diào)白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）mRNA 的 表 達(dá) 水平［10］。相關(guān)研究認(rèn)為吸煙可增加慢阻肺的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［11］，因此本研究擬以HBE細(xì)胞為研究對(duì)象，探討香煙提取物對(duì)HBE細(xì)胞抗衰老因子Klotho的影響及相關(guān)治療措施的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2016年3月至2017年8月在儀隴縣人民醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康人員30例作為對(duì)照組，其中男20例，女性10例，年齡（61.32±6.78）歲，范圍為45～73歲。選擇同期在該院經(jīng)肺功能檢查確診的慢阻肺病人30例，除合并高血壓、糖尿病、冠心病、自身免疫系統(tǒng)疾病、癌癥、哮喘、結(jié)核病等嚴(yán)重疾病，且近2周內(nèi)未使用茶堿或糖皮質(zhì)激素，其中男性21例，女性9例，年齡（60.54±6.44）歲，范圍為45～72歲。兩組人群性別比例（χ2＝1.021，P＝0.102）、年齡（t＝0.812，P＝0.412），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBE細(xì)胞購(gòu)于北京腫瘤研究所。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，病人或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書(shū)。

1.2 香煙提取物制備取兩根剪去過(guò)濾嘴的香煙，在改良的注射器驅(qū)動(dòng)裝置一端點(diǎn)燃，使香煙燃燒產(chǎn)生的煙霧以50 mL/min的速度通過(guò)該裝置，并使其溶在10 mL 1640培養(yǎng)基中。之后調(diào)節(jié)溶液PH值為7.4，再以0.22 μm微孔濾器過(guò)濾。香煙提取物需現(xiàn)用現(xiàn)制，并保證每次在制備后的30 min內(nèi)開(kāi)始使用。上述方法制備的香煙提取物為100%，使用時(shí)以1640培養(yǎng)基稀釋至合適濃度。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理HBE細(xì)胞使用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3天進(jìn)行1次傳代，在細(xì)胞對(duì)數(shù)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HBE細(xì)胞，以2×105/mL的密度接種于6孔板，分為對(duì)照組（A組），模型組（B組），陽(yáng)性對(duì)照組（C組），地塞米松低劑量組（D組）、地塞米松中劑量組（E組）、地塞米松高劑量組（F組）（其中D、E、F組為實(shí)驗(yàn)組），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共3塊6孔板。陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入1%香煙提取物處理24 h，之后陽(yáng)性對(duì)照組給予外源性200×10-12mol/L Klotho蛋白處理，實(shí)驗(yàn)組分別在共培養(yǎng)1 h后分別給予1×106mol/L，1.5×106mol/L和2×106mol/L的地塞米松。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 （1）健康與慢阻肺人群外周血細(xì)胞因子mRNA表達(dá)檢測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)兩組外周血細(xì)胞因子IL-8、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、Klotho表達(dá)水平。（2）ELISA檢測(cè)不同刺激條件下HBE細(xì)胞釋放炎性因子水平，收集藥物處理24 h及對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-20℃保存，測(cè)定時(shí)從冰箱取出試劑盒，在室溫下平衡，各孔分別加入50 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，輕輕混勻1 min，以密封膜密封，25℃孵育2 h；之后倒掉板內(nèi)液體，每個(gè)孔中加入250 μL洗滌液洗滌，再次倒掉液體，反復(fù)洗滌5次，最后拍干。之后依次進(jìn)行加50 L生物素標(biāo)記抗體于樣品或標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)，洗板，加100 L辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗生物素鏈菌素（Streptavidin-HRP）酶聯(lián)二抗溶液于各孔，用密封膜封住板孔，37 ℃孵育45 min；洗板，加100 L 3，3’，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溶液，室溫避光反應(yīng)孵育30 min；每孔分別加入100 μL終止反應(yīng)液；使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。（3）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)不同刺激條件下HBE細(xì)胞釋放炎性因子mRNA水平，收集藥物刺激3 h及對(duì)照組細(xì)胞樣品，每個(gè)樣品加入1 mL Trizol試劑，吹打收集細(xì)胞樣品于1.5 mL無(wú)RNA酶離心管，指彈，室溫靜置15 min，存放于-20℃保存?zhèn)溆?。測(cè)定時(shí)，采用RNA提取試劑盒提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后采用RT-qPCR進(jìn)行測(cè)定。引物由Invitrogen公司合成，引物序列如下，Human IL-8：sense，5′-CTCTTGGCAGCCTTCCTGATT-3′Antisense，5′-TATGCACTGACATCTAAGTTCTTTAGCA-3’；Human IL-6：sense，5′-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3′Antisense，5′-CATCTTTGGAAGGTTCAGGTTGT-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料滿足方差齊性和正態(tài)分布，采用xˉ±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，在方差分析有意義的基礎(chǔ)上，再采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多組間的兩兩比較；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。均以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康與慢阻肺人群外周血細(xì)胞因子檢測(cè)慢阻肺病人外展血IL-8，IL-6及TNF-α含量均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；慢阻肺病人外周血Klotho蛋白含量顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 健康與慢阻肺人群外周血細(xì)胞因子檢測(cè)/（pg/mL，xˉ±s）

2.2 ELISA檢測(cè)各組HBE細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平 如下表2所示，單因素方差分析結(jié)果顯示，各組間IL-8、IL-6和TNF-α均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)組間兩兩比較結(jié)果顯示，B組細(xì)胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B組細(xì)胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α表達(dá)水平高于D、E、F組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。D、E、F組細(xì)胞上清液中IL-8、IL-6、TNF-α含量依次降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 ELISA檢測(cè)各組HBE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性因子含量/（pg/mL，xˉ±s）

2.3 RT-PCR檢測(cè)各組HBE細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平如下表3所示，單因素方差分析結(jié)果顯示，各組間IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)組間兩兩比較結(jié)果顯示，B組細(xì)胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。B組細(xì)胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平高于D、E、F組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。D、E、F組細(xì)胞IL-8 mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平依次降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 RT-PCR檢測(cè)各組HBE細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá)水平/xˉ± s

3 討論

煙草煙霧中含有大量的自由基和其他多種有毒物質(zhì)，對(duì)人體可造成多種危害，如細(xì)胞癌變、氣道損傷以及肺功能障礙等［12-13］。其中，長(zhǎng)期吸煙病人慢阻肺的發(fā)病率明顯偏高，其主要發(fā)病機(jī)制為慢性氣道炎癥、上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。研究表明，中性粒細(xì)胞激活在吸煙引起的肺功能損傷過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，其中IL-8、IL-6和TNF-α等炎性因子在中性粒細(xì)胞趨化過(guò)程中發(fā)揮重要作用［14-15］。在此背景下，本研究首先對(duì)健康人群及慢阻肺人群肺功能和外周血細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平進(jìn)行分析，進(jìn)而通過(guò)以HBE細(xì)胞構(gòu)建模型，探討抗炎藥地塞米松對(duì)香煙提取物誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞炎性因子升高的影響，為臨床選擇合理的治療方式提供依據(jù)。

本研究結(jié)果表明慢阻肺病人外展血IL-8，IL-6及TNF-α水平均顯著高于對(duì)照組；慢阻肺病人外周血Klotho蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。上述結(jié)果說(shuō)明慢阻肺病人外周血炎性因子含量顯著升高，這與相關(guān)研究［14-15］報(bào)道基本相符。此外，慢阻肺Klotho蛋白含量表達(dá)顯著降低，Klotho作為一種Ⅰ型跨膜蛋白，在腎臟、大腦組織分別較多，具有重要的生物功能。有研究表明Klotho基因發(fā)生突變的小鼠可表現(xiàn)出類(lèi)似肺氣腫的多種癥狀，如出現(xiàn)肺泡壁斷裂、肺泡腔變大、呼吸時(shí)間變長(zhǎng)等。因此，Klotho蛋白功能異常可能與肺氣腫形成，進(jìn)而影響慢阻肺病情進(jìn)展。

此外，體外實(shí)驗(yàn)表明，B組細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-8、IL-6、TNF-α含量顯著高于A組，這一結(jié)果表明以香煙提取物作為體外刺激HBE細(xì)胞構(gòu)建支氣管慢性炎癥的模型是成功的。B組細(xì)胞IL-8、IL-6、TNF-α含量高于D、E、F組。D、E、F組細(xì)胞IL-8、IL-6、TNF-α含量依次降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)RT-qPCR結(jié)果，B組細(xì)胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著高于A組。B組細(xì)胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平高于D、E、F組。D、E、F組細(xì)胞IL-8、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平依次降低。上述結(jié)果說(shuō)明，地塞米松能夠下調(diào)香煙提取物引起的HBE細(xì)胞炎性因子分泌增加。其原因可能是地塞米松能夠減輕和避免組織對(duì)炎癥的過(guò)度反應(yīng)，從而有助于減輕臨床多種炎癥表現(xiàn)。此外，作為一種激素類(lèi)藥物，其能抑制包括巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在炎癥部位聚集，同時(shí)抑制吞噬作用、溶酶體酶的釋放，對(duì)多種炎癥化學(xué)中介物的合成和釋放均可產(chǎn)生影響［16-17］。從而有助于炎性因子水平的降低，緩解炎性癥狀。

綜合上述分析，可得出結(jié)論，香煙提取物體外刺激HBE細(xì)胞，可顯著降低Klotho因子含量，同時(shí)上調(diào)多種炎性因子基因的表達(dá)，體外給予地塞米松干預(yù)能夠降低HBE細(xì)胞炎癥反應(yīng)。