趙春苗,程小剛 ,余擎
根管治療術(shù)存在一定的失敗率,這些病例的失敗主要是由于根管內(nèi)的細(xì)菌沒有被完全清除[1]。經(jīng)過根管治療的患牙根管系統(tǒng)的內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量減少,也就是說經(jīng)過治療的根管為細(xì)菌提供的是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境[2],這時(shí)候細(xì)菌通過自身的適應(yīng)性機(jī)制以饑餓的狀態(tài)來(lái)適應(yīng)新的環(huán)境[3]。Stuart CH等[4-6]對(duì)根管治療后發(fā)生再感染的病例進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),約24%~77%的根管中有糞腸球菌(enterococcus faecalis),它還可以長(zhǎng)期饑餓生存并形成生物膜。
現(xiàn)有的應(yīng)用最多的根管沖洗劑是不同濃度的次氯酸鈉(NaClO)。Liu H等[7]的研究發(fā)現(xiàn)次氯酸鈉對(duì)饑餓態(tài)的糞腸球菌生物膜有殺菌作用,所以本實(shí)驗(yàn)選用次氯酸鈉作為陽(yáng)性對(duì)照。PH值約為2.3~2.7的強(qiáng)酸性電解質(zhì)水(strong acid electrolytic water,SAEW)[8-9],由于它的安全性和抗菌效果較好,從二十幾年前便被嘗試用作根管沖洗劑[10]。Cheng X等[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SAEW能殺滅糞腸球菌,但SAEW能否殺滅饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜還需要研究。本實(shí)驗(yàn)于2019年3—5月通過微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察SAEW對(duì)饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜的殺菌作用。
1.1 主要試劑與儀器糞腸球菌凍干株ATCC 29212(空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體實(shí)驗(yàn)室);腦心浸液培養(yǎng)基(BHI;Difco,MI,美國(guó));SAEW用專用的電解質(zhì)水生成裝置-電解質(zhì)水生成儀(Alfa Light;Amano Co.,日本)電解1 g/L的氯化鈉溶液陽(yáng)極獲得;5.25%次氯酸鈉溶液(空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院);Biofuge Stratos型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Kendro,USA);24孔板(NUNCLON;Nunc,Roskilde,Denmark);干燥機(jī)(ES-2030,Hitachi,日本);離子濺鍍系統(tǒng)(Lon Sputter E-1045,Hitachi,日本);掃描電子顯微鏡(SEM,S-4800,Hitachi,日本)。
1.2 糞腸球菌饑餓狀態(tài)誘導(dǎo)及饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜的形成參考Heim等[12]的方法,將糞腸球菌(ATCC 29212)凍干菌株復(fù)蘇后培養(yǎng)4 h,獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的糞腸球菌菌液,細(xì)菌密度約為1.5×109CFU/mL。在4℃條件下,低溫離心機(jī)以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min獲取糞腸球菌沉淀,把沉淀溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶液中,再低溫離心并溶于PBS中,重復(fù)兩次后溶于PBS溶液中,調(diào)節(jié)細(xì)菌密度為109CFU/mL。調(diào)節(jié)好密度的細(xì)菌懸液置于37℃恒溫箱中在厭氧避光的條件下培養(yǎng)48 h,獲得饑餓態(tài)糞腸球菌。
將11×11 mm2蓋玻片(已高溫高壓滅菌器滅菌)置于24孔板中。滴1 mL饑餓態(tài)糞腸球菌菌液。37℃厭氧靜止培養(yǎng)24 h后饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜形成。
1.3 不同沖洗劑對(duì)饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜的殺菌作用觀察將饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜分成9組,每組20個(gè)樣本,分別用5.25%次氯酸鈉、SAEW以及0.9%氯化鈉溶液(NS)處理1、5和10 min。處理后用PH=7的PBS緩沖液輕柔地洗去殘留的處理液。每組中的10個(gè)樣本用震蕩的方法得到處理后的樣本,將菌液涂布于BHI平板,37℃厭氧培養(yǎng)24 h后,用活菌計(jì)數(shù)法得到被處理后細(xì)菌存活率。
每組中另10個(gè)樣本在4℃條件下用2.5%戊二醛隔夜固定。固定后用50%、70%、80%和90%的乙腈進(jìn)行梯度脫水,每個(gè)濃度脫水20 min;接著100%的乙腈脫水2次,每次20 min。然后用干燥機(jī)二氧化碳臨界點(diǎn)干燥,干燥后用離子濺鍍系統(tǒng)噴金,噴金以后SEM觀察[13]。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,美國(guó))對(duì)不同沖洗劑處理后細(xì)菌存活率xˉ±s進(jìn)行方差分析。同一組別不同時(shí)間點(diǎn)比較以及同一時(shí)間點(diǎn)三組比較,用方差分析中的SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
2.1 不同沖洗劑處理后活菌計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示,同一沖洗液1、5、10 min不同時(shí)間組之間進(jìn)行組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)SAEW和5.25%次氯酸鈉各時(shí)間組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),也就是說SAEW和5.25%次氯酸鈉對(duì)饑餓態(tài)糞腸球菌有殺滅作用,且處理1 min時(shí)的效果最弱,處理5 min時(shí)殺菌效果增強(qiáng),處理10 min時(shí)的殺菌效果最強(qiáng)。同一時(shí)間不同沖洗液組間比較發(fā)現(xiàn),SAEW和5.25%次氯酸鈉都有一定的殺菌作用,且殺滅效果都比NS組強(qiáng)(P<0.05),同時(shí)5.25%次氯酸鈉處理1 min和5 min時(shí)對(duì)饑餓態(tài)糞腸球菌的殺滅作用比SAEW的作用強(qiáng)(P<0.05);但是處理10 min組時(shí)兩組的殺滅作用接近(P>0.05)。說明SAEW對(duì)饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜有有效的殺滅作用,且處理10 min的殺菌效果接近5.25%次氯酸鈉處理10 min的殺菌效果。
表1 不同沖洗液處理后的細(xì)菌存活率/(%,xˉ±s)
2.2 SEM觀察的結(jié)果SEM觀察結(jié)果顯示(圖1,2),饑餓態(tài)的糞腸球菌生物膜由皺縮失水的細(xì)菌細(xì)胞形成,細(xì)菌細(xì)胞表面凹凸不平、均一性較差。隨著NS處理時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)菌細(xì)胞皺縮失水現(xiàn)象加重;SAEW和5.25%次氯酸鈉處理后不僅有嚴(yán)重的皺縮失水現(xiàn)象,還出現(xiàn)了細(xì)菌細(xì)胞的溶解和破壞、細(xì)胞膜表面有穿孔和碎片樣改變,而且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)菌細(xì)胞的破壞更加嚴(yán)重。這提示SAEW和5.25%次氯酸鈉可能具備對(duì)饑餓態(tài)的糞腸球菌生物膜相似的殺滅機(jī)制。
圖1 未處理的饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜掃描電子顯微鏡圖片(×50 000)
根管治療術(shù)是臨床治療牙髓、根尖周病的常用手段[14]。Sun J等[15]的研究表明,在根管治療失敗的病例中糞腸球菌是主要的致病菌。經(jīng)過嚴(yán)密的充填,根管內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏、氧氣稀少,這時(shí)候根管內(nèi)沒有被清理和殺滅的細(xì)菌微生物就會(huì)以饑餓的狀態(tài)生存[16-17]。糞腸球菌有一種長(zhǎng)時(shí)間耐受饑餓的能力,只要環(huán)境中出現(xiàn)能被它利用的養(yǎng)分,它就可以很快吸收養(yǎng)分恢復(fù)活性并造成根管系統(tǒng)的再次感染[18]。
現(xiàn)代觀點(diǎn)認(rèn)為,在根管治療過程中根管系統(tǒng)有沒有有效地清理是治療是否成功的重要步驟;通過機(jī)械預(yù)備清理根管內(nèi)的感染物質(zhì)、化學(xué)沖洗作用對(duì)根管進(jìn)行清洗消毒,兩者結(jié)合以達(dá)到有效清理根管的目的[19]?,F(xiàn)在常用的根管沖洗劑次氯酸鈉是應(yīng)用的最多的沖洗劑[20]。Siqueira等[21]的研究表明,只要根管治療過程用次氯酸鈉進(jìn)行根管沖洗,糞腸球菌的檢出率就顯會(huì)著降低。但是次氯酸鈉作為根管沖洗劑其殺菌的最佳濃度、溫度、作用時(shí)間等都不確定[20,22]。而且次氯酸鈉沖洗后牙本質(zhì)的膠原纖維會(huì)被去除,從而降低牙本質(zhì)的粘接性能[23]。此外,較高濃度的次氯酸鈉有一定的細(xì)胞毒性和刺激性作用,可能會(huì)造成根尖周組織的損傷[24-26]。次氯酸鈉還可能會(huì)引起病人的過敏反應(yīng)[27]。所以次氯酸鈉雖然應(yīng)用廣泛但并不是最理想的。Cheng X等[11]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SAEW安全性好且對(duì)糞腸球菌(非饑餓態(tài))有殺滅作用,本研究就在原有研究的基礎(chǔ)上研究SAEW對(duì)饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜的殺菌作用。
本研究的活菌計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)表明,SAEW對(duì)饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜具有有效的殺滅作用,且作用10 min的殺菌效果和5.25%次氯酸鈉作用10 min的殺菌效果接近。SEM實(shí)驗(yàn)表明,SAEW和5.25%次氯酸鈉處理饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜后,細(xì)菌細(xì)胞皺縮失水現(xiàn)象加重,此外有的細(xì)胞發(fā)生溶解、破壞,細(xì)胞膜表面有穿孔和碎片樣改變,而且這種變化隨著處理時(shí)間地延長(zhǎng)而更加明顯。研究表明,未解離的次氯酸是次氯酸鈉主要的殺菌成分[21]。次氯酸、氯氣、過氧化氫以及氫氧根離子的共同作用使SAEW有一定的殺菌作用[11]。相似的酸性成分使次氯酸鈉和SAEW處理后有相似的細(xì)菌形態(tài)的變化。
圖2 處理后的饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜掃描電子顯微鏡圖片(×50 000)
綜上,SAEW對(duì)饑餓態(tài)糞腸球菌生物膜有有效的殺滅作用,且殺菌效果與5.25%次氯酸鈉的殺菌效果接近,殺菌機(jī)制也類似。聯(lián)合以往研究,SAEW對(duì)多種微生物有殺滅作用[28]。此外,SAEW在根管沖洗過程中還可以去除根管玷污層、對(duì)根尖周組織的細(xì)胞毒性低、使用后還原成水不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染等優(yōu)點(diǎn)[28-30]。因此可以考慮用SAEW作為根管沖洗劑替代5.25%次氯酸鈉,但是目前還沒有實(shí)驗(yàn)證明SAEW具有組織溶解性,所以SAEW作為根管沖洗劑還需要進(jìn)一步的研究。