劉璐璐,唐敏,宋莎莎,江威,徐詩(shī)霞,黃山,陳治東,章禮久
急性重癥胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的特殊類(lèi)型,是一種進(jìn)展快、并發(fā)癥多、病死率高的急腹癥[1-2],占AP的10%~20%。目前對(duì)該病的發(fā)病機(jī)制和病變過(guò)程缺乏深入認(rèn)識(shí)。因此,選擇合適的SAP建模方法對(duì)研究SAP具有深遠(yuǎn)意義。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),建立AP模型的方法主要包括侵襲性和非侵襲性操作[3-4],其中侵襲性操作有逆行胰膽管注射法[5]、直接胰管結(jié)扎術(shù)法[6]、微泵注入法[7]及胰腺被膜下注射等。直接胰管結(jié)扎和微泵注入等方法對(duì)手術(shù)器械條件及術(shù)者的手術(shù)技能要求極高,操作難度極大,不利于推廣。胰腺被膜下注射法為胰腺被膜下打針?lè)ǎ?]改良設(shè)計(jì)。非侵襲性操作包括:L-精氨酸(L-Arginine)注射法[9-10]、雨蛙素注射法[11-12]、無(wú)膽鹽乙硫氨酸(CDE)[13]喂養(yǎng)法等,但都適用于誘導(dǎo)輕型胰腺炎動(dòng)物模型。除了上述造模方法,還有胰腺直接損傷法[14],Harisa GI等[15]報(bào)道的大鼠尾靜脈注射泰洛沙泊(Tyloxapol)的高脂血癥性AP方法。而另有電針刺激法、高鈣血癥法、動(dòng)脈注射微球法、免疫介導(dǎo)法以及不同方法聯(lián)合應(yīng)用等多種類(lèi)型[16]的AP動(dòng)物模型建立方法。但臨床上最常見(jiàn)的胰腺炎類(lèi)型為膽源性胰腺炎。本研究主要為模擬膽源性胰腺炎機(jī)理,建立對(duì)手術(shù)器械條件要求不高、操作時(shí)間短、可重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、死亡率低的SAP動(dòng)物模型。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠75只,雄性,體質(zhì)量范圍為200~250 g,購(gòu)于北京維通利華公司,6周,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):170018,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,簡(jiǎn)單隨機(jī)化分組法分為五組:假手術(shù)組、精細(xì)注射組6 h、精細(xì)注射組24 h、被膜下組6 h、被膜下組24 h,每組15只。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 在胰島素筆中注入?;悄懰徕c(5 g/100 mL滅菌水,5%)。配制好的5%?;悄懰徕c裝入自制的胰島素筆的3 mL針管中,每0.1毫升換算10個(gè)單位,按照0.1 mL/100 g進(jìn)行總量計(jì)算,根據(jù)大鼠體質(zhì)量計(jì)算胰島素筆的注射量,準(zhǔn)備試驗(yàn)器械及背景燈光。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 麻醉方法 腹腔注射10%水合氯醛(10 g水合氯醛,用無(wú)菌水配置成10%濃度的液體,4℃保存),按1 mL/100 g劑量麻醉。
1.2.2 手術(shù)方法 手術(shù)臺(tái)上,大鼠給予備皮,消毒。精細(xì)注射法:仰臥固定,從腹部正中口切開(kāi)約2 cm,逐層分離,將十二指腸輕輕提起,背景燈光照射下沿著腸系膜下方找出膽胰管口,用血管鉗輕輕夾閉開(kāi)口上下約5 mm處,在膽管距腸壁15 mm處用鑷子輕輕夾住。用胰島素筆連接BD針頭避開(kāi)血管,斜向穿刺腸壁至十二指腸乳頭區(qū),在胰膽管開(kāi)口處,朝向膽管方向,深入2~3 mm,以0.1 mL/min的速度緩慢逆行注射入膽管內(nèi),待胰腺變色、水腫時(shí)結(jié)束手術(shù),關(guān)閉腹腔(圖1)。被膜下法:腹壁正中切口入腹,尋找胰腺組織及被膜,用胰島素筆將所需體積的?;悄懰徕c分次多部位注射入被膜下。假手術(shù)組:行開(kāi)腹手術(shù),開(kāi)腹后翻動(dòng)胃腸即關(guān)腹。上述操作僅行1次。
1.2.3 術(shù)前和術(shù)后管理 大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。術(shù)后使用燈光照射,選用側(cè)臥位或仰臥位,觀(guān)察大鼠術(shù)后呼吸運(yùn)動(dòng)情況,必要時(shí)給予更換體位或心肺復(fù)蘇。
1.2.4 血清學(xué)檢測(cè) 各組大鼠分別于造模后6 h、24 h處死,頸動(dòng)脈穿刺采血,離心機(jī)4 000 r/min離心10 min,取上層清夜置于-20℃冰箱凍存,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組血清淀粉酶含量。
1.2.5 胰腺組織病理學(xué)檢查 將實(shí)驗(yàn)大鼠分別在造模后6 h、24 h處死,取胰腺,選取胰腺多部位組織用4%多聚甲醛溶液固定2 h,常規(guī)制成4 m的石蠟組織切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色,在光鏡下觀(guān)察胰腺組織病理學(xué)改變,并根據(jù)Kusske標(biāo)準(zhǔn)對(duì)組織切片進(jìn)行評(píng)分。
1.2.6 成模率統(tǒng)計(jì) SAP診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為組織病理,需同時(shí)可見(jiàn)組織明顯水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及出血壞死表現(xiàn),以此來(lái)統(tǒng)計(jì)各組大鼠成模率。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用xˉ±s描述,各組間整體比較采用單因素方差分析、多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)及率表示,比較采用χ2檢驗(yàn)(整體+分割χ2檢驗(yàn))。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組大鼠死亡率比較假手術(shù)組大鼠均存活,死亡率為0%(0/15)。30只精細(xì)注射組大鼠均存活,死亡率為0%(0/30)。被膜下組有兩只大鼠在造模過(guò)程中因穿刺胰腺血管導(dǎo)致出血性休克而死亡,死亡率6.67%(2/30)。組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.2 手術(shù)時(shí)間比較手術(shù)時(shí)間數(shù)據(jù)列于下表1。被膜下組較精細(xì)注射組手術(shù)時(shí)間明顯縮短(P<0.05)。
表1 各組手術(shù)時(shí)間比較
2.3 各組血清淀粉酶比較如表2所示,整體比較(單因素方差分析)可知:整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析:與假手術(shù)組比較,其余各組血清淀粉酶含量均顯著升高(P<0.05);精細(xì)注射組24 h較精細(xì)注射組6 h血清淀粉酶含量明顯升高,且較被膜下組6 h也顯著升高(P<0.05)。
2.4 胰腺組織病理學(xué)變化造模結(jié)束后,光鏡下觀(guān)察胰腺組織病理并進(jìn)行胰腺炎嚴(yán)重程度評(píng)分??梢?jiàn)(圖2):精細(xì)注射組6 h與被膜下組6 h的胰腺細(xì)胞水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、壞死改變不明顯。被膜下組24 h可見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫以及少量的出血壞死表現(xiàn)。精細(xì)注射組24 h可見(jiàn)廣泛凝固性壞死伴出血,壞死區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清,實(shí)質(zhì)內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
參考胰腺炎Kusske評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)以上病理圖片進(jìn)行評(píng)分,結(jié)果如表2所示,整體比較(單因素方差分析)可知:整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析:與假手術(shù)組比較,其余各組胰腺炎病理評(píng)分均顯著升高(P<0.05);與6 h比較,24 h的胰腺炎病理評(píng)分明顯升高(P<0.05);與被膜下組24 h比較,精細(xì)注射組24 h的胰腺炎病理評(píng)分明顯升高(P<0.05)。
表2 各組血清淀粉酶、胰腺炎病理評(píng)分比較/xˉ±s
2.5 各組成模率比較如表3所示,整體比較(χ2檢驗(yàn))可知:整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析:假手術(shù)組、被膜下組6 h和精細(xì)注射組6 h均無(wú)成模大鼠。精細(xì)注射組24 h較被膜下組24 h的成模率明顯升高(P<0.05)。
表3 各組成模率比較
?;悄懰徕c是人體內(nèi)2種膽汁酸的主要成分之一,選用?;悄懰徕c可模擬膽總管下段梗阻時(shí)膽汁酸反流引起的AP[17-18]。
在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)大鼠選擇戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,但發(fā)現(xiàn)術(shù)后大鼠多出現(xiàn)逐漸呼吸衰竭而死亡,死亡率極高。后選擇水合氯醛麻醉后大鼠死亡率明顯降低,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)大鼠死于麻醉。
大鼠SAP模型誘導(dǎo)方法主要包括逆行胰膽管注射法和被膜下多點(diǎn)注射法。本研究發(fā)現(xiàn)被膜下多點(diǎn)注射?;悄懰徕c法較逆行胰膽管注射法時(shí)間較短。但由于胰腺組織供血豐富,被膜下血管分布密集,多點(diǎn)注射時(shí)易導(dǎo)致出血,且血管較細(xì),難以用止血鉗止血,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中兩只大鼠均因失血性休克死亡,故手術(shù)操作風(fēng)險(xiǎn)及難度較大。逆行胰膽管注射法大多具有重復(fù)性好、模型穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn),病理改變存在劑量依賴(lài)性與時(shí)間依賴(lài)性,但此類(lèi)方法均需通過(guò)顯微鏡反復(fù)精確調(diào)整角度,對(duì)膽管進(jìn)行切開(kāi)或穿刺置管,因膽管纖細(xì),手術(shù)難度極大。且胰膽管隔著十二指腸腸壁,腸壁血管豐富,易發(fā)生失血性休克。
本研究對(duì)逆行胰膽管注射法進(jìn)行改良,首次采用十二指腸乳頭區(qū)精細(xì)注射法,使用胰島素筆注入牛磺膽酸鈉的方式控制給藥劑量和速度。選擇對(duì)十二指腸乳頭朝向膽管開(kāi)口的部位精細(xì)注射,保證一部分?;悄懰徕c進(jìn)入膽管,同時(shí)乳頭水腫,避開(kāi)十二指腸管壁血管,誘導(dǎo)SAP。此種方法無(wú)須進(jìn)行膽管切開(kāi)或?qū)δ懝苓M(jìn)行穿刺置管,對(duì)膽管損傷小,基本無(wú)出血,操作難度顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),十二指腸乳頭區(qū)精細(xì)注射法與被膜下多點(diǎn)注射法相比較,手術(shù)時(shí)間稍長(zhǎng),但無(wú)死亡大鼠,誘導(dǎo)的模型大鼠血清淀粉酶含量升高顯著,且呈進(jìn)行性升高。精細(xì)注射法胰腺組織病理可見(jiàn)廣泛凝固性壞死伴出血,壞死區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清,實(shí)質(zhì)內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),且根據(jù)Kusske標(biāo)準(zhǔn),胰腺組織病理評(píng)分顯著高于被膜下組。綜上,十二指腸乳頭區(qū)精細(xì)注射法具有成模率高、病理典型、與臨床SAP狀態(tài)相符的特點(diǎn)。
十二指腸乳頭區(qū)精細(xì)注射法需要實(shí)驗(yàn)者掌握一定的外科手術(shù)技能,具備相應(yīng)的解剖學(xué)知識(shí)。操作過(guò)程需在背景燈光照射下,避開(kāi)十二指腸腸壁血管,正確識(shí)別膽管、胰管,找到膽胰管共同開(kāi)口處,朝向膽管開(kāi)口方向,注射速度要緩慢且均勻。(本文圖1,2見(jiàn)插圖12-1)
圖1 牛磺膽酸鈉十二指腸乳頭區(qū)精細(xì)注射法示意
圖2 各組胰腺組織病理圖片(HE染色×400):A為假手術(shù)組;B為被膜下組6 h;C為被膜下組24 h;D為精細(xì)注射組6 h;E為精細(xì)注射組24 h