李燕，同曉霞，楊曉莉

女金膠囊、調(diào)經(jīng)丸、舒爾經(jīng)顆粒、活血止痛膏等中藥成方制劑，具有祛寒止痛、活血通絡(luò)、理氣止痛等功效。這幾種中成藥中均含有陳皮和牡丹皮成分，陳皮為蕓香科植物，其性溫、味苦等，具有理氣健脾、燥濕化痰等功效，橙皮苷為中藥陳皮藥材中的有效成分［1-3］；牡丹皮具有清熱涼血、活血散瘀的功效，具有保肝護(hù)腎、鎮(zhèn)靜、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛等多重藥理作用，丹皮酚為中藥材牡丹皮中的有效成分［4-6］。由于這幾種中成藥使用范圍較廣，所含藥味繁多，一直難以建立橙皮苷和丹皮酚含量測定的方法［7-16］。為更好的控制產(chǎn)品的質(zhì)量，保障人民群眾的用藥安全與有效，本研究于2017年6—10月建立一種利用高效液相色譜儀，以橙皮苷和丹皮酚為檢測指標(biāo)，定量測定上述中成藥中橙皮苷和丹皮酚的含量的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器高效液相色譜儀：安捷倫1200主機(jī)（安捷倫科技有限公司）；檢測器：G4212A多波長檢測器（美國agilent）；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 m）（安捷倫科技有限公司）；電子天平：梅特勒XS205DU（梅特勒科技有限公司）；數(shù)控超聲波清洗機(jī)：SK3300LH型（廣州滬瑞明儀器有限公司）；渦旋混合器：T25，3 000～18 000 r/min（廣州IKA公司）；高速冷凍離心機(jī)：H2100R型（湘儀離心機(jī)公司）；純水儀：Milli-Q（密理博科技有限公司）。

1.2 材料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：橙皮苷（含量96.1%，批號(hào)110721—201617，中國食品藥品檢定研究院）；丹皮酚（含量99.9%，批號(hào)110708—201407，中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 試劑甲醇：色譜純（德國默克公司）；磷酸：分析純（國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；純化水：自制。

1.4 色譜參數(shù)Agilent ZORBAX SB-C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 m）；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 L；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：0.2%磷酸溶液；檢測波長：279 nm；掃描波長：190～400 nm。梯度洗脫設(shè)置見表1。

表1 梯度洗脫設(shè)置

1.5 溶液制備對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液：取橙皮苷和丹皮酚對(duì)照品各約25 mg，精密稱定，置于同一個(gè)25 mL量瓶中，加甲醇約15 mL溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻（橙皮苷和丹皮酚質(zhì)量濃度均為：1.0 μg/mL）。標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：取對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液適量，制成濃度分別為0.2、0.4、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻。

供試品溶液：取中成藥（以女金膠囊為例），取供試品10粒，分別精密稱定重量，傾出內(nèi)容物，計(jì)算裝量差異；取裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物，研缽研成細(xì)粉，取約0.2 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇約30 mL，超聲提取約20 min；放置至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻；取上述溶液，0.45 m濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇取橙皮苷對(duì)照品一定量，配制含有橙皮苷質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同法配制丹皮酚5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，橙皮苷在（274±2）nm范圍內(nèi)有最大吸收；丹皮酚在（284±2）nm范圍內(nèi)有最大吸收。為提高橙皮苷和丹皮酚檢測靈敏度，故選擇279 nm作為色譜檢測波長。

2.2 流動(dòng)相的選擇試驗(yàn)分別選擇0.2%磷酸溶液與甲醇體系和0.2%磷酸溶液與乙腈體系對(duì)橙皮苷和丹皮酚進(jìn)行洗脫。試驗(yàn)證明，選擇乙腈體系時(shí)，橙皮苷出峰速度較快，出峰時(shí)間在4.21 min，但基質(zhì)干擾較嚴(yán)重，定量結(jié)果不準(zhǔn)確；選擇甲醇體系時(shí)，橙皮苷和丹皮酚能夠較好的分離，且甲醇相對(duì)于乙腈對(duì)試驗(yàn)人員及環(huán)境的影響更小，故試驗(yàn)選擇0.2%磷酸溶液與甲醇體系作為流動(dòng)相，典型譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察取對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液適量，制成濃度分別為0.2、0.4、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻；取上述溶液分別進(jìn)樣分析，以各對(duì)照品溶液的濃度（X）與其對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）做線性擬合曲線，結(jié)果橙皮苷和丹皮酚在0.2～20.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系；取對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋至各對(duì)照品色譜峰峰高分別達(dá)到3倍信噪比，計(jì)算檢出限。結(jié)果見表2。

圖1 以0.2%磷酸溶液與甲醇體系作為流動(dòng)相測定橙皮苷和丹皮酚含量的高效液相典型譜圖

表2 曲線方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 回收率試驗(yàn)取已知含量的供試品樣品，精密稱取約0.2 g，分別加入適量的對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液，配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的供試品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3份，按1.4設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，橙皮苷回收率在92.6%～100.9%之間；丹皮酚回收率在90.6%～98.2%之間。結(jié)果見表3。

2.5 精密度考察取供試品樣品，按1.5供試品溶液配制方法進(jìn)行樣品前處理，得到供試品溶液。按1.4設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)樣分析。同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明，橙皮苷測定結(jié)果精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%；丹皮酚測定結(jié)果精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.11%。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性與穩(wěn)定性取供試品樣品，按1.5供試品溶液配制方法進(jìn)行樣品前處理，得到供試品溶液。同法配制6份供試品溶液。按1.4設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，橙皮苷測定結(jié)果重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.14%；丹皮酚測定結(jié)果重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.76%；再取重復(fù)性溶液1份，室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按1.4設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)樣分析。測得橙皮苷和丹皮酚的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.51%和2.71%，結(jié)果表明，在此試驗(yàn)條件下，供試品溶液能夠穩(wěn)定放置24 h。

2.7 方法應(yīng)用實(shí)例《中國藥典》2015年版中，女金膠囊、調(diào)經(jīng)丸、舒爾經(jīng)顆粒、活血止痛膏均未建立橙皮苷［17］191和丹皮酚［17］172的含量測定方法，采用藥典方法檢測陳皮和牡丹皮中橙皮苷和丹皮酚時(shí)，需要分開配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，檢測效率偏低、溶劑用量大、環(huán)境友好度低。取上述四種中成藥樣品，按1.5供試品溶液配制方法進(jìn)行樣品前處理，得到供試品溶液；按1.4設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)樣分析，測定橙皮苷和丹皮酚的含量；同時(shí)參照《中國藥典》2015年版一部中陳皮和牡丹皮中橙皮苷和丹皮酚測定方法，對(duì)上述中成藥進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，該方法可同時(shí)測定橙皮苷和丹皮酚的含量，檢測結(jié)果與藥典基本一致。結(jié)果見表4。

表4 樣品檢測結(jié)果/%

3 討論

本試驗(yàn)研究建立一種利用高效液相色譜法檢測女金膠囊等四種中成藥中橙皮苷和丹皮酚定量檢測的方法。首先對(duì)試驗(yàn)的色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化：優(yōu)化了檢測波長、流動(dòng)相體系；考察了方法的線性曲線、回收率、檢出限、精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等，結(jié)果表明，該方法適用于女金膠囊等四種中成藥中橙皮苷和丹皮酚含量的檢測，對(duì)制假、售假中成藥等不法商販形成威懾，為國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)制定和中成藥風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供技術(shù)依據(jù)。試驗(yàn)證明，該方法具有前處理簡單、檢出限低、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，可以用于上述女金膠囊等四種中成藥的質(zhì)量控制。